氨海水与5-羟色胺对栉孔扇贝解剖卵的体外促熟作用.pdf

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1、第41卷第4期2011年4月中国海洋大学学报PERI()DICAL0F0CEANUNIVERSITY0FCHINA41(4)：046～050Apr．。2011氨海水与5一羟色胺对栉孔扇贝解剖卵的体外促熟作用。邸炜鹏，王昭萍“，于瑞海，周珊珊，顾玲玲，李宁(中国海洋大学海水养殖教育部重点实验室，山东青岛266003)摘要：研究氨海水与5一羟色胺(5-HT)对栉孔扇贝解剖获得卵母细胞的促熟作用。通过体外浸泡的方法处理栉孔扇贝卵母细胞使其成熟，并完成人工受精。结果表明一定浓度的氨海水可显著促使栉孔扇贝卵母细胞生发泡破裂，但

2、经过氨处理的卵母细胞受精率却不高；5-羟色胺不能诱导栉孔扇贝卵母细胞生发泡破裂，但可有效地使已经发生生发泡破裂的卵母细胞进一步成熟。先用氨海水处理然后用5一羟色胺处理可以得到最佳诱导效果，受精率可达(40．02士2．73)％。关键词：栉孔扇贝；体外成熟；氨海水；5-羟色胺中图法分类号：s961．2+2文献标志码：A文章编号：1672—5174(2011)04-046—05双壳贝类的繁育过程中，常采用解剖取卵、人工授精的方法，以避免精液过多的现象[1]。然而，贝类的卵子多是分批成熟分批产出的，解剖获得的卵子存在成熟度不

3、够及发育不同步现象，对其进行体外促熟是必要的。目前关于贝类解剖卵的体外促熟研究报道不多，仅见于太平洋牡蛎(Crassostreagigas)[2]、马氏珠母贝(Pinctadamartensii)[3

4、、紫扇贝(Argopectenpurpu—ratus)[引、硬壳蛤(Mercenariamercenaria)[5I、浪蛤(Spisula)[6]等几种贝类中。已有的研究结果表明海水浸泡、维生素、氨海水(AmmoniaSeawater，AS)、5一羟色胺(5一HT)、组胺等对贝类的解剖卵都有一定的促熟作用。栉孔扇贝(C

5、hlamysfar理一)是我国北方重要的养殖贝类，因其解剖卵无法完成受精作用，卵子都是通过自然产出或诱导排放的途径获得，迄今未有其解剖取卵、体外促熟的报道。本研究采用氨海水和5一羟色胺(5一HT)对栉孔扇贝的解剖卵进行体外促熟研究，通过对生发泡破裂(GerminalVesicleBreakdown，GVBD)情况和受精情况的分析来衡量2种试剂的促熟作用，探索扇贝解剖取卵、人工受精的可行性，最后通过氨和5一羟色胺的双因子处理建立了栉孑L扇贝解剖获卵的体外促熟技术，该技术将在栉孔扇贝的繁殖和遗传操作中得到应用，并且对于建

6、立相关类型贝类卵母细胞的体外促熟技术均有借鉴。1材料与方法1．1精卵的获得实验用栉孔扇贝亲贝为青岛海区养殖的成熟2龄贝(壳长6．19cm4-0．5cm，壳宽2．24am±0．2cm，壳高6．65cm±0．6cm，体质量54．86g士3．5g)。亲贝经过暂养稳定后，挑选发育良好的亲贝，解剖获得精卵[7]。将卵液用100目筛绢滤去较大组织块后，再用500目筛绢去除组织液和微小杂质；精液用300目筛绢过滤，选用上层，并检查精子活性。1．2卵母细胞的促熟室温(20℃)-F，在几支15mL试管中加入等量卵液，再加入等量不同浓度

7、的处理液，控制卵密度为500---1000个／mL，摇匀计时。氨海水单独处理时，处理浓度梯度设定为：0．0025％、0．005％、0．01％、0．015％、0．020％和0．025％(以分析纯氨水25％～26％为100％)。处理时间梯度为：15、30、45和60min。5一羟色胺单独处理时，处理浓度梯度设定为：0．001、0．002、0．003和0．004mol／L。处理时间梯度为：15、30、45和60rain。联合处理时，选取前面2组中较好的浓度加以混合，并根据情况特别添加了先用氨海水浸泡再用5一羟色胺浸泡的处理

8、组(T组)。处理时间同上。选用在正常海水中浸泡的卵母细胞作为对照，每次实验设3个平行组。1．3人工授精取出处理完毕的卵液，用500目筛绢过滤，洗去处理液，加入5mL小瓶中，再滴入1～2滴活力旺盛的精子，摇匀。受精过程中尽量多晃动。1．4观察记录GVBD发生率、受精率·基金项目：国家自然科学基金项目(30771622)；国家高技术研究发展计划项目(2006AAl0A401)资助收稿日期：2010—Ol一22；修订日期：20lO一03—23作者简介：邸炜鹏(1984一)，男，硕士生，主要从事贝类遗传育种研究。E-mail

9、：diweipen905110@163．C0121··通讯作者：E-mail：zpwang(孕OUC．edu．cn醉蚌鹏，等氨海水々5羟乜胺Ⅳ栉扎痢Ⅲ解剁卵白勺体外促熟作月受精2～3h后．取样进行显微拍照．照片用于计算GVBD笈‘l：率、受精率。GVBD发生率=发生GVBn的细胞数／细胞总数×100％；受精率一正常卵裂的细胞数，细胞总数×i00