淫羊藿苷诱导人脐带间充质干细胞分化为成骨细胞的实验研究.pdf

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1、AthesissubmittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofMasterEffectofIcariineontheformationsofMesenchymalstemcellsofHumanumbilicalcordto0steoblasts，BvZhangFan，一SupervisorProf．WuXuejianDepartmentoforthopedicsTheFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversityMay2011y{原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下

2、，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文作者：死q陟日期跏f／，年j月佃日学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位

3、论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。。学位论文作者：歹爱寸见日期：乃f／年岁月‘，Ik■熏I；l11,}$。；誊摘要淫羊藿苷诱导人脐带间充质干细胞分化为成骨细胞的实验研究硕士研究生：张帆导师：吴学建郑州大学第一附属医院骨科河南郑州450052背景和目的人脐带问充质干细胞的体外分离及定向培养是目前组织工程学的热点。研究淫羊藿苷对人脐带间充质干细胞的生物学作用，以及诱导其向成骨细胞分化的可能。尝试为骨组织工程找到一个新的体外诱导成骨细胞的方案。方法无菌条件下取39"'40周健康产妇

4、剖腹产后lh的脐带(均征得产妇及其家属同意)，去除外膜及血管后，将脐带组织剪碎，接种于培养瓶中。采用贴壁培养法培养并传代。倒置显微镜观察细胞形态及生长情况，免疫细胞化学染色法鉴定细胞表面抗原标志物(CD34，CD44，CDl05，CD45)。取生长状态良好的第3代细胞进行细胞爬片，待细胞生长至80％．90％融合时分为2组进行诱导分化，空白对照组加入基础培养基，实验组加入淫羊藿苷和基础培养基诱导培养。倒置显微镜下观察其形态并检测成骨细胞标志物ALP、碱性磷酸酶染色、碱性磷酸酶活性测定、钙化结节的检测。将结果进行统计学分析。结果脐带问充质干细胞原代细胞培养4天后，可见组织块周围

5、细胞成放射状生长，类似成纤维细胞，形态均一，贴壁状态。培养15天后，培养瓶有80％．95％融合，按照l：2或者1：3的比率传代，传代后4h细胞贴壁，1-6代细胞12h贴壁率>85％，24h贴壁率可达90％。6一-8d细胞长满瓶底，细胞融合率可达100％。传代I摘要细胞在生长的过程中呈现间充质干细胞的形态特点。第3代脐带间充质干细胞免疫组化染色，显示表面标CD44、CDl05强阳性，CD34、CD45阴性，检测结果符合人UCMSCs的特征。诱导培养后形态学检测：实验组可见大量脐带间充质干细胞由漩涡状排列向多角形，立方形细胞发展。空白对照组干细胞无明显变化。成骨性检测：随着培养

6、天数的增加，实验组诱导后细胞液中成骨细胞特征性碱性磷酸酶强阳性表达并且有钙沉积。实验组细胞内ALP含量与对照组比较有显著性差异(P<0．001)，实验组钙化结节染色强阳性。结论本实验证明了人脐带中可以提取干细胞并在体外采用组织块贴壁培养法培养，传代，增殖。在一定情况下可以向成骨诱导。在向成骨诱导方面，淫羊藿苷对人脐带间充质干细胞的增殖和成骨分化具有促进作用，可作为骨性诱导因子，在脐带间充质干细胞治疗骨缺损，骨坏死方面有着广阔的前景。关键词脐带；间充质干细胞；淫羊藿苷；成骨细胞U、＼I：一：引卜卜l：¨㈡f一AbstractEffectofIcariineontheforma

7、tionsofMesenchymalstemcell,,ofhumanUmbilicalcordto0steoblast：stemcellso11UilicalcortoUste01astsDepartmentoforthopedics，TheFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversityZhengzhouHenan450052backgroundand0bjectiveSeparationofmesenchymalstemcellsobtainedfromhumanumb