hTERT RNAi和外源性PUMA基因联合作用促MCF-7细胞凋亡机制的初步研究.pdf

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1、1．11．21．31．41．51．61．71．81．923／删㈣㈣hTERTRNAi和外源性PUMA基因联合作用促MCF．7细胞，凋亡机制的初步研究摘要目的：构建靶向人端粒酶逆转录酶(hTEI汀)基因的RNA干扰(I斟Ai)真核表达载体和PUMA基因的真核表达载体，探讨hTERT蛋白和PUMA蛋白在MCF．7细胞中表达的相关性及hTERT基因干扰和外源性PUMA基因联合作用促MCF．7细胞凋亡的可能机制，为hTERT基因干扰和外源性PUMA基因联合作用作为肿瘤基因治疗策略的应用提供依据。方法：根据hTERT基因的RNA干扰靶序列GGA

2、ACACCAAGAAGTTCATCT，设计合成具有该靶序列短发夹结构的寡核苷酸，退火形成双链DNA，并定向克隆到真核表达载体pYr-2．1．hU6形成重组质粒pYr-2．1．hTERT-shRNA。将重组质粒转化感受态细胞DH5a，经Kanar抗性筛选和CCDB致死基因筛选，挑选阳性克隆菌落进行摇菌扩增，并抽提纯化质粒，然后将抽提的重组质粒进行SacI酶切和琼脂糖电泳分析，同时做测序鉴定以确定插入的干扰片段准确无误。同法构建不针对任何基因的shRNA阴性对照质粒pYr-2．1．HK。将PUMA基因序列(genebankNM一01441

3、7)克隆入质粒pYr-ads．1，构建PUMA真核表达质粒pYr-ads．1．PUMA，转化感受态细胞DH5a，经Kana。抗性筛选，挑选阳性克隆菌落进行摇菌扩增，并抽提纯化质粒，然后将抽提的重组质粒进行BamHI和EcoRl双酶切和琼脂糖电泳分析，同时做测序鉴定以确定插入的PUMA基因片段准确无误。用表达绿色荧光蛋白(EGFP)的质粒pYr-2．1-EGFP和表达红色荧光蛋白(RFP)的质粒pYr-ads一1．RFP检测MCF．7细胞的转染效率。实验设6个组：空白对照组、hTERT阴性对照组、PUMA空载体对照组、pYr-2．1-h

4、TERT-shRNA组、pYr-ads．1．PUMA组、pYr-2．1．hTERT-shRNA／pYr-ads一1-PUMA组，前五组分别以每孔脂质体lO“l、质粒4峙配成转染复合物，加入各组MCF一7细胞中进行转染(空白对照组不加任何试剂)，联合组每孔pYr02．1．hTERT-shRNA和pYr-ads一1一PUMA各4嵋，脂质体201al。于转染后48h裂解各组细胞提取总蛋白，通过Westernblot检测各组细胞hTERT、PUMA、Bcl．2、Bax、Caspase．3蛋白的表达。结果：1．重组质粒pYr-2．1一hTERT

5、-shRNA经SacI酶切鉴定和测序鉴定证实目的序列已准确插入到预计位点，重组质粒构建成功。2．重组质粒pYr-ads．1．PUMA经BamHI和EcoRI双酶切鉴定和测序鉴定证实目的序列已准确插入到预计位点，重组质粒构建成功。3．转染后48h荧光显微镜下观察，根据发荧光的MCF．7细胞所占比率判断LipofectamineTM2000转染MCF．7细胞的转染效率约60％。4．免疫印迹Westernblot分析显示：pYr-2．1．hTERT-shRNA组和pYr-2．1．hTERT-shRNA／pYr-ads．1．PUMA联合组hT

6、ERT蛋白的相对表达量与三个对照组相比均下降约52％，差异具有统计学意义(PO．05)，pYr-ads．1．PUMA组与三个对照组相比hTERT蛋白表达差异无显著性(尸>O．05)；pYr-ads．1．PUMA组和pYr-2．1．hTERT-shRNA／pYr-ads．1．PU

7、MA联合组PUMA蛋白的相对表达量与三个对照组相比均增加约145．3％，差异具有统计学意义(氏O．05)，2与pYr-2．1．hTERT-shRNA组相比增加约147．7％，差异具有统计学意义(P<0．05)，而pYr-ads-1-PUMA组与pYr-2．1-hTERT-shRNA／pYr-ads一1．PUMA联合组之间PUMA蛋白表达差异无显著性(P>0．05)，pYr-2．1．hTERT-shRNA组与三个对照组相比PUMA蛋白表达差异无显著性(P>0．05)；pYr-2．1一hTERT-shRNA组和pYr-2．1一hTERT-

8、shRNA／pYr-ads一1-PUMA联合组Bcl．2蛋白的相对表达量与三个对照组相比均下降约25．1％，差异具有统计学意义(P