感染性疾病分子诊断2013.ppt

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1、分子诊断学陈昌杰病因内因和外因两大类内因主要指遗传因素，如基因结构、基因表达状况的改变，其中基因结构的改变包括点突变、插入、缺失、重排、易位、基因结构多态性变异、前病毒插入等；而基因表达状况改变则包括转录产物的结构或表达量的异常。外因是指外在的环境因素，如生活方式、工作环境、精神状况和各种感染性病原体的侵入等。第十章感染性疾病的分子诊断分子诊断（moleculardiagnosis）是指通过检测基因的结构异常或其表达异常，对人体的健康状态和疾病作出诊断的方法。评估基因的存在和缺陷通常以DNA为材料，而评估基因的表达量则以基因转录或翻译的产物RNA/蛋白质分析来评估个体的生理/病理

2、状态。分子诊断技术主要包括核酸杂交聚合酶链式反应（PCR）基因芯片技术感染性疾病即由病原微生物引起的疾病的统称。外源性感染：指由外界致病病原体侵人人体后导致的感染，如伤寒、病毒性肝炎等多为外源性感染。内源性感染：指由人体自身的正常菌群，在人体免疫功能下降时引起的感染，因为这些细菌必须在一定条件下才能致病，所以又称为条件致病菌或机会致病菌，如肠道菌群中的大肠埃希菌、肠球菌等引起的感染多为内源性感染。分子诊断对感染性疾病可用于以下几个方面：适用不易培养的；种属鉴定；早期诊断；动态监测；流行病学调查；基因分型；耐药检测。感染性病原体进行分子诊断，取决于两个条件：一是在该病原体核酸中有

3、特异的核酸序列（感染性病原体本身含有一些保守序列，即使在不同的基因型这些保守序列的变异也很小，因此可以根据保守序列设计探针或引物）；二是能够根据特异的核酸序列设计和制备具有特定信号的探针或设计合成相应PCR引物，多数感染性疾病的病原体都具备上述两个条件。诊断策略可以分为以下两种：一般性检出策略完整检出策略一般性检出策略所提供的感染性病原体的信息量较少，几乎不提供型别（包括变异株）和耐药性方面的信息，因此，对于感染感染性疾病分子诊断一般性策略只是快速诊断是何种病原体的感染。为了得到更多的疾病病原体信息，建议应该采取完整策略按照诊断→分型→亚型→耐药性检测的思路，利用多种分子诊断手段

4、对感染性病原体进行分析。第一节病毒的基因检测人类许多感染性疾病由病毒引起，如肝炎、脑炎、脊髓灰质炎、流行性感冒、狂犬病、艾滋病等。根据病毒的核酸成分，可将其分为脱氧核糖核酸（DNA）病毒和核糖核酸（RNA）病毒两大类。一、乙型肝炎病毒乙型肝炎病毒（hepatitisBvirus,HBV）是引起病毒性肝炎的主要病原体之一，属嗜肝DNA病毒科的原型病毒，病毒毒粒中含内源性DNA聚合酶活性。嗜肝病毒科有独特的复制方式，病毒合成以RNA中间体为模板，经反转录合成DNA链，在某些方面，HBV与逆转录病毒有许多相似性。乙型肝炎病毒(HBV)感染是一个严重的全球问题,据估计全球大约有20亿人曾

5、经感染乙肝病毒,慢性HBV感染者约315亿~4亿人,每年有50万~120万人死于HBV感染。我国是乙型肝炎的高发区,每年约有10%~20%的急性乙肝将转成慢性肝炎,肝硬化甚至发展成肝癌,严重威胁着人们的健康,急性乙肝的慢性化及慢性肝炎癌变的发生机制是多年来肝病研究的重点。HBV感染的病原学诊断免疫血清学检测HBV的血清学标志物分子生物学方法检测免疫学方法测定病毒抗体是一种快速简便的检测手段,常用的方法是间接ELISA,目前我国HBV检测采用的第三代ELISA试剂由多种病毒抗原组合匹配,具有较好的灵敏性和特异性,但其在病毒感染的窗口期不能检测到抗体,这在很大程度上限制了ELISA检

6、测的准确性,不能有效的控制病毒的传播,因而,发展新的诊断HBV感染主要依赖分子生物学技术对病毒DNA的检测。（一）病毒基因组结构HBV是一种可感染人体、且具有独立复制能力的双链DNA病毒，具有以下几个特点：①不完全双链环状结构；②利用重叠的开放读码框架(ORF)可编码多个蛋白质；③所有调控序列均位于蛋白质编码区；④基因序列具有多变性。HBV基因组是已知可感染人类又能独立进行复制的双链DNA病毒中最小和最高效的。HBV基因组具有独特的结构，是一个长约3.2kb的不完全双链环状DNA。双链的长度不对称，长链(L)因与病毒mRNA互补，定为负链；短链(S)为正链，5’末端固定，3’末端

7、位置不固定，S正链的长度可为L负链的50~100%，因而在病毒群体中出现不同长度的正链与全长的负链匹配，故仅有部分基因组长度为双链。HBV基因组L链上至少有4个ORF，分别称为S、C、P和X，编码外膜蛋白、核壳蛋白、聚合酶和X蛋白。多个ORF重叠的结果使HBV本身3.2kb基因组序列的利用率高达150~200%。（二）分子诊断方法1．PCR2.支链DNA技术3.核酸杂交4.基因芯片技术逆向斑点杂交法原理就是将各种探针固定在基质上,用以检测受检的各种标记样品中与探针互补的核酸物质的