双醋瑞因微生物限度检验方法研究.pdf

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1、双醋瑞因微生物限度检验方法研究曹紫霞陈雅(台州市星明药业有限公司，浙江台州318000)摘要：采用薄膜过滤法消除双醋瑞因的抑茵性，进行微生物限度检验方法的研究，确认需氧茵、霉菌和酵母茵以及控制茵的检测方法，从而获得更真实的检测数据，以满足双醋瑞因的日常检测需求。关键词：薄膜过滤法；微生物计数法；控制茵检查法当检品有抑菌性时，它们会掩盖无菌药品已受污染的事实或造成低于实际污染水平的菌检结果，双醋瑞因本身含有抑菌性，为保证检查方法的准确性，必须先消除其抑菌性，消除抑菌性的方法有很多，比如增加稀释液体积，加入中和剂，薄膜过滤法等等。本文主要采用薄膜过滤法对双醋瑞因的微生物计数方

2、法和控制菌检查方法进行研究，从而确认通过该方法检验样品不会对微生物检验后果产生任何影响。1材料和方法1．1实验材料与仪器设备1．1．1培养基：胰酪大豆胨琼脂、沙氏葡萄糖琼脂、胰酪大豆胨液体、沙氏葡萄糖液体、麦康凯液体、麦康凯琼脂1．1．2稀释液：pH7．0氯化钠蛋白胨缓冲液(样品品稀释)、0，9％的NaCI(菌种稀释)1．1．3实验菌株：金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉1．1．4实验设备：垂直双人净化工作台、生物安全柜、霉菌培养箱、生化培养箱、立式蒸汽灭菌器、电热恒温干燥箱、微生物限度检验仪。1．2实验前准备所有容器、用具经过处理

3、，160。C干烘2小时。培养基于高压蒸汽灭菌器中按照适宜的温度灭菌并进行过培养基适用性检查，整个操作过程中避免微生物污染。1．3方法研究1．3．1微生物计数法方法适用性研究1．3．1．1供试液的制备：称取样品109，加入100mlpH7．0氯化钠一蛋白胨缓冲液，摇匀，静置，作为供试液1：10。1．3．1．2接种和稀释(1)试验组：取(1：10)样品上清液lml，薄膜过滤法，用400ml稀释液分4次冲洗，最后一次冲洗加入不大于100cfu的试验菌lml，抽滤，取出滤膜冲洗面朝上贴于培养基上。(A组)(2)菌液组：取试验菌不大于100cfu，薄膜过滤法，用稀释液少量冲洗，抽滤

4、，取出滤膜冲洗面朝上贴于培养基上(B组)。(3)供试品对照组：取(1：10)供试液上清液lml，薄膜过滤法，用400ml稀释液分4次冲洗抽滤，取出滤膜冲洗面朝上贴于培养基上。(C组)1．3．1．3需氧菌计数方法适用性研究：以金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉为试验菌株，照A组、B组、C组滤膜制备方法，分别制备滤膜，贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平板上，置于30～35℃培养箱中培养。金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌平皿培养3天；白色念珠菌、黑曲霉、c组平皿培养5天。1．3．1．4霉菌和酵母菌计数方法适用性验证：以白色念珠菌、黑曲霉为试验菌株，

5、照A组、B组、C组滤膜制备方法，分别制备滤膜，贴于沙氏葡萄糖琼脂平板上，置于霉菌培养箱中20-25℃培养5天。1．3．2控制菌检查法(大肠埃希菌)方法适用性研究1．3．2．1验证菌种：大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌。1．3．2．2供试液制备和增菌培养(1)试验组(促生长能力试验)取1：10供试液上清液10ml，薄膜过滤，用400ml稀释液分4次冲洗，最后一次冲洗加入不大干100cfu的大肠埃希菌lml，取出滤膜置于100ml的胰酪大豆胨液体培养基中。(A组)(2)阴性菌对照组(抑制能力试验)取1：10供试液上清液10ml，置于薄膜过滤器中，用400ml稀释液分4次冲洗，最后一

6、次冲洗加入不大于100cfu的金黄色葡萄球菌lml，取出滤膜置于100ml的胰酪大豆胨液体培养基中。(B组)(3)供试品对照组取1：10供试液10ml置于薄膜过滤器中，用400ml稀释液分4次冲洗，抽滤，取出滤膜置于100ml的胰酪大豆胨液体培养基中。(C组)(4)阳性菌液组取不大于100cfu的大肠埃希菌lml，薄膜过滤法，少量冲洗，取出滤膜置于100ml的胰酪大豆胨液体培养基中。(D组)1．3．2．3选择和分离培养将上述A、B、C、D组置于恒温培养箱中30～35qC培养18小时，取上述培养物lml分别接种至10(hnl麦康凯液体培养基中，42～44％培养24小时。取麦

7、康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上30—35℃培养18小时，观察结果。2结语2．1取三个批次的双醋瑞因样品进行实验，按照培养情况计数每个平皿的菌落数，试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组的菌数比值均在O．5～2范围内。各试验菌的回收试验均符合要求，确认该方法可进行双醋瑞因的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数。2．2在上述培养时间下进行观察，可检出所加试验菌相应的反应特征即试验组应检出试验菌、阴性菌对照组未检出阴性对照菌。确认该方法可进行双醋瑞因的控制菌检查。2．3通过上述研究可以确定通过薄膜过滤法检查双