rAAV介导的含Tet-On调控元件的HSVtkGCV自杀基因系统对乳腺癌细胞DNA损伤效应的初步研究.pdf

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1、论文题目：rAAV介导的含Tet．On调控元件的HSVtl淝CV自杀基因系统对乳腺癌细胞DNA损伤效应的初步研究学科、专业：生物化学与分子生物学研究生姓名：李弘德导师姓名及其专业技术职称：曾赵军副教授胡维新教授中南大学二零一一年五月一夸一一，牛直月分类号VDC硕士学位论文密级Tet．On调控rAAV介导的HSVtk／GCV自杀基因系统对乳腺癌细胞的DNA损伤效应的初步研究TheprimarystudyontheeffectsofDNAdamagecausedbyrAAV-mediatedHSVtk／GCVsu

2、icidegenetherapysystemundertheregulationofTet·-Oninbreastcancercells作者姓名：李弘德学科专业：生物化学与分子生物学学院(系、所)：生物科学与技术学院第一指导教师：曾赵军副教授第二指导老师胡维新教授论文答辩日期．迎!!至!盟!旦答辩委员会主席中南大学二零一一年五月一苓一一，年丑月Ⅲ4㈣5舢9洲4M卅眦Ⅲ●-Ⅲ9iⅣii●l洲Y，原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注

3、和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。作者签名：夸列缸日期：迦12年—互月上-_日学位论文版权使用授权说明本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论

4、文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。作者签名：避导师签名』王壑车日期：丝!』年盟月丛日r

5、本课题受如下基金资助：国家自然科学基金资助项目一“恶性肿瘤基因治疗中Tet调控自杀基因系统的表达和增敏性机理研究’’(批准号：30600753)硕士学位论文中文摘要摘要乳腺癌是女性主要的恶性肿瘤之一。自杀基因疗法是基因治疗的重要策略，它通过转基因的方法将人类不具有的自杀基因导入肿瘤细胞内，其表达产物可将无毒性的药物前体转化为有毒性的代谢产物，影响细胞的生物合成，导致细胞死亡。我们利用重组

6、腺相关病毒介导的含Tet-On调控元件的HSVtk／GCV自杀基因治疗系统对人类乳腺癌细胞株MCF-7进行杀伤性实验，结合彗星实验与WesternBlotting、RT-PCR等实验技术初步研究该系统对乳腺癌细胞的DNA损伤影响及其作用的分子机理。第一章rAAV介导的含Tet-On调控元件的HSVtk／GCv自杀基因系统对乳腺癌细胞DNA的损伤影响将pAAV／TRE／Tet-On／HSVtk、pHelper和pAAV-RC三质粒通过磷酸钙共沉淀转染至病毒包装细胞HEK293T，获得了重组腺相关病毒rAAV瓜E

7、／Tet．On／HS诎。对浓缩纯化后的rAAV，以斑点杂交的方法检测并计算rAAV的物理滴度为2．O×1011／ml。以rAAV／TRE／Tet．On／HSVtk、Dox和GCV处理乳腺癌细胞，实验分为rAAV+Dox+GCV组、rAAV+DOX组、rAAV+GCV组、rAAV组及阴性对照组。彗星实验检测自杀基因治疗系统对该细胞DNA损伤的影响，结果显示，药物处理细胞48h后，rAAV+Dox+GCV组的细胞相对其他各组，细胞有明显的彗星拖尾现象。通过统计分析彗尾面积百分率和彗矩检测HSVtk自杀基因系统处理

8、细胞前后造成的DNA损伤程度，结果发现，rAAV+Dox+GCV组的细胞相对其他各组，其DNA迁移程度明显增大(P

9、。结合此结果，选取DNA损伤反应相关的活性基因进行RT-PCR实验。RT-PCR验证了ATM、p53、p27、CyclinE与CD怼在rAAV+Dox+GCV处理组与各对照组细胞之间的表达水平，结果显示ATM、p53与p27表达显著上调，而CyclinE与CDK2则没有表达差异。利用WesternBlotting研究自杀基因治疗系统干预后细胞DNA损伤后相关蛋白ATM、p53、p27、CyclinE