聚乙烯亚胺介导的e1a基因对肝癌细胞的化疗增敏效应

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1、聚乙烯亚胺介导的E1A基因对肝癌细胞的化疗增敏效应：孙海丰，刘东方，刘永彪【摘要】目的以自行合成的聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)纳米凝胶为载体转染E1A基因，并观察E1A基因对肝癌细胞体外生长的抑制作用及其对化疗药物的增敏效应，初步探讨其作用机制。方法经PEI介导，将真核细胞高效表达E1A基因的重组质粒psv-E1A导入人肝癌H22细胞，RT-PCR证实其转染，G418筛选出阳性克隆细胞，观察EIA基因对该细胞系生长的抑制作用。用MTT法测定转染E1A基因前后，顺铂、泰素、5-氟尿嘧啶、博来霉素对肝癌H22细胞的效应。

2、结果质粒psv-E1A测序结果与基因库E1A基因序列完全相符。G418筛选出阳性克隆细胞。RT-PCR结果显示PEI能转染质粒psv-E1A并有稳定的表达。转染E1A基因后，H22-E1A细胞对顺铂、博来霉索、泰素的敏感性显著提高（P<0.01），而对5-氟尿嘧啶的敏感性无明显变化（P>0.05）。结论PEI能正常转染质粒psv-E1A,E1A基因能够明显抑制肝癌H22细胞的生长，并明显提高其对顺铂、博来霉索及泰素等化疗药物和放射线的敏感性。其机制可能与E1A基因改变肿瘤细胞的增殖状态和细胞周期时相有关。【关键词】E1A基因；基因

3、转染；肝癌细胞；聚乙烯亚胺；四甲基偶氨唑盐微量染色法基因治疗的载体主要分为病毒载体系统和非病毒载体系统。由于病毒载体有免疫原性高、毒性大、目的基因容量小、靶向特异性差、制备较复杂及费用较高等缺点，人们愈来愈重视非病毒载体的研究。非病毒载体较安全，免疫原性低,而且是基于质粒的转染，易于组装。聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)是近年来研究最为广泛的阳离子多聚物非病毒基因载体之一，1995年，Boussif等［1］首先报道了PEI可作为非病毒载体。其后,PEI成为非病毒载体研究发展最快的领域，其中线型和支链状的PEI是研究最活跃

4、、基因转导效率最高的阳离子聚合物之一。基因治疗的另一个关键是目的基因，E1A基因可以作用于肿瘤细胞的多个癌基因和抑癌基因，如调控p53、HER-2/neu、RB和nm23等癌基因和抑癌基因；并且E1A基因的作用不依赖肿瘤细胞的基因状态，这使得E1A基因治疗较其他针对单一癌基因或抑癌基因的基因治疗(如p53基因)具有更好的应用价值和前景。本研究以PEI为载体，将真核细胞高效表达E1A基因的重组质粒psv-E1A导入人肝癌细胞系H22，RT-PCR证实其转染，用MTT法测定转染E1A基因前后，顺铂、泰素、5-氟尿嘧啶（5-Fu）、博来霉素对肿瘤细

5、胞敏感性的作用,对阐明高分子树枝状纳米载体在肿瘤靶向治疗中的安全、有效转导机制有重要意义和较大的应用价值。　　1材料和方法　　1.1材料　　1.1.1PEI纳米凝胶　　本课题利用掌握粒径精确可控纳米凝胶光化合合成方法，以水溶液光化学法合成具有各种粒径的PEI纳米凝胶［2-3］。具体参数见表1。表1PEI的参数（略）　　1.1.2psv-E1A质粒　　由上海东方肝胆医院苏长青教授惠赠,在DH5-α菌株中扩增，用DNA质粒纯化试剂盒(QIAGEN公司)制备质粒。质粒D260/D280比值在1.6～1.9之间,过滤除菌，－20℃保存。　　1.1.3

6、转染细胞　　H22肝癌细胞购自南京凯基生物科技发展有限公司，生长在含10%小牛血清（FCS）的RPMI1640培养基中。　　1.2方法　　1.2.1实验步骤　　本实验应用PEI转染质粒psv-E1A入肝癌细胞，G418筛选其阳性克隆细胞，RT-PCR证实，分别加顺铂、博来霉素、泰素、5-Fu入阳性克隆细胞及未转染的细胞，24h后MTT法测量生存率,观察E1A基因对多种作用机制不相同的化疗药物有无增敏作用。　　1.2.2基因设计与测序　　从基因库内查E1A基因序列,并设计引物。上游引物：5′-cggaggtgttattaccgaag-3′；下游

7、引物:5′-tcgtcactgggtggaaagcc-3′。E1A基因测序结果与从基因库内下载的E1A基因序列完全一致。　　1.2.3基因转染　　转染复合物的N/P比值对转染效率的影响很大。N/P比值指的是转染复合物中PEI分子所含的N原子与DNA分子中所含的P原子的摩尔比。1μg的DNA分子中含有3nmol的P原子。按照不同的N/P比值调整PEI溶液(4.3mg/ml)的使用量(表2)。表2不同N/P比值的PEI溶液的使用量（略）　　1.2.4PCR反应　　按表3制备50μlPCR反应：离心数秒，上PCR仪扩增，琼脂糖凝胶电泳观察结果。表3

8、PCR反应组成（略）　　1.2.5琼脂糖凝胶电泳　　9μlDNA样品中加入2μl上样缓冲液混匀，混匀后的样品加入样品口中上样,100V、60mA电泳30min。