tet-on系统调控分离酶上调表达对hela细胞生物学性状影响的初步研究

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1、第三军医大学硕士学位论文Tet—on系统调控分离酶上调表达对Hela细胞生物学性状影响的初步研究摘要一、研究背景和目的姐妹染色单体的分离是由分离酶(s印arase)水解粘合素(cohes耐SCCl)后发生。姐妹染色单体的分离是一精确时空调控事件，分离的紊乱会造成遗传物质传递的不稳定性，导致细胞的非整倍性(aIleuploidy)，从而引起细胞或个体的死亡或病态【l】。现在普遍认同一种保守的机制参与姐妹染色单体的分离：随着姐妹染色单体复制的完成，姐妹单体之间也随之建立由cohesion维持的结合【2】。有丝分裂后期，

2、体内后期促进复合物(APC／C)泛素化降解保全素(securin)【3、41，从而促使激活的s印araSe裂解cohesion，引发姐妹染色单体的分离【5、们。随着研究的深入，人们对s印arase在真核细胞姐妹染色单体分离中的机制有了进一步认识：脊椎动物cohesill的解离分两步：第一步发生在前期和前中期，主要裂解大部分染色体臂上的cohesin，此过程主要涉及Pole．1ikekinase(Plkl)和A1lrora．B，尤其P墩1对Scc3和SA2亚基的磷酸化是cohesin在分裂前期和前中期裂解所必需的【7

3、】；第二步在后期，中心粒区域的cohesin通过secllrin—s印arase通路而降解【8】。着丝粒处的cohesin没有被前期裂解途径降解的原因在于shugoshins对其的保护【9、10】。S印arase表达异常影响细胞基因组不稳定性、肿瘤形成敏感性。W瓠zenegger等的研究显示，人类细胞通过RN础抑制Espl表达后，形成了含有大叶状核的多倍体细胞，在这些细胞有丝分裂过程中，许多细胞都含有不分离的姐妹染色单体【111。Ka血GWiml等发现小鼠separase等位基因条件敲除能够阻止染色体的分离，但是无

4、法阻止有丝分裂的其他特征，如胞质分离，染色体的复制掣12】。JenlliferL-sh印ard等通过诱变剂N．甲基N．硝基N．亚硝基．胍作用于s印araSe基因突变的斑马鱼，结果所有肿瘤的发生率增加O．25倍，而上皮性肿瘤发生率增加O．8倍【131。S印arase能促进细胞凋亡的发生。u11m锄等指出Espl(s印araSe)功能类似caspases，二者同属于半胱氨酸蛋白酶，二者在C端含有保守的半胱氨酸残基，该残基正是Caspases的催化活性基团【14J。Pati和Chen在2002年分别提出：cohesion

5、瓜ad2l亚基的裂解会引起细胞凋亡【15、16】。2005年AtienzaJM进一步报道：对Rad21进行7第三军医大学硕士学位论文RNA干扰，减少Rad21rI瓜NA的表达后发现肿瘤细胞增殖受到抑制，凋亡增加【17】。Hui‰g等研究发现，在过氧化氢诱导下，酵母细胞中类似caSpases的separaSe通过切割类似Rad21的Mcdl诱导凋亡【18】。s印arase在细胞遗传物质的传递、基因组不稳定性、肿瘤敏感性及凋亡中的重要作用引起我们极大关注。但是目前国内、外的研究集中在正常真核细胞s印嬲e功能方面，而关于

6、s印araSe在肿瘤细胞中的作用还没有文献报道。既然有研究发现分离酶低表达或不表达可以增加肿瘤易感性，我们就假设如果让本来s印arase低表达的肿瘤细胞高表达，那么其生物学性状会不会发生改变呢?我们选择Hela细胞作为研究的细胞株，主要是其异常染色体均数多达85条，和正常宫颈上皮细胞染色体46条差别明显，有利于观察染色体改变。随着研究的进展，我们证实了上调表达的s印arase可以在一定程度上逆转肿瘤细胞的恶性程度，那么这种现象是否和s印arase上调表达肿瘤细胞的凋亡改变有关呢?本研究就Hela细胞(肿瘤细胞)中s

7、印arase上调表达后对生物学性状影响做初步的研究。二、方法和结果1．Tet—on系统表达调控模型的建立：质粒PSK．Espl用EcoRI，SacII双酶切，胶回收目的片段Espl，定向克隆插入pTRE．d2EGFP，转入大肠杆菌后挑出正确的重组子，采用Ⅺ10I，SphI双酶切鉴定插入方向，测序鉴定其序列的正确性，成功构建ESpl．pⅡ也．d2EGFP表达载体。利用FuCmNE6脂质体转染PTct．on质粒，转染24h后加G418(200n∥m1)，筛选2周后挑选单个细胞克隆扩大培养。将Espl-pTRE—d2EG

8、FP质粒与PTK．Hyg质粒按摩尔比为20：1转染已经成功转染PTet—on质粒的Hela细胞中，转染24h后加G418(600斗∥m1)，潮霉素(200斗∥m1)，筛选2周后挑选单个细胞克隆扩大培养。用FQ．PCR、WB分别在mRNA和蛋白水平上检测目的基因Espl的表达水平，结果发现强力霉素(DOx)的最适诱导浓度为200n∥m1，EsplmRNA从0．