喹噁啉类对肾上腺皮质醛固酮合成酶表达调控的影响

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1、华中农业大学硕士学位论文喹噁啉类对肾上腺皮质醛固酮合成酶表达调控的影响姓名：杨春辉申请学位级别：硕士专业：基础兽医学指导教师：袁宗辉201206喹嗯啉类对肾上腺皮质醛固酮合成酶表达调控的影响专业：兽医药理学与毒理学2012届硕士研究生：杨春辉指导老师：袁宗辉教授(国家兽药残留基准实验室(HZAU)／农业部食品安全评价重点开放实验室，华中农业大学中国武汉430070)摘要喹嗯啉类药物(Quinoxalines)是具有喹嗯啉．1，4-z．氧化物基本结构的，促进动物生长的广谱抗菌促生长动物专用药，主要包括卡巴氧(Carbadox

2、，CBX)、喹乙醇(Olaquindox，OLA)、喹赛多(Cyadox，CYA)、喹烯酮(Quinocetone，QCT)和乙酰甲喹(Mequindox，MEQ)等五种药物。有研究证实喹嗯啉类药物中大多数药物都发现对动物机体的肾上腺有毒性影响，如卡巴氧、喹乙醇、喹赛多持续给药能够导致猪肾上腺毒性，抑制猪体内醛固酮合成，引起水盐代谢失衡。在进一步研究中也证实了卡巴氧及其代谢物能够不可逆的抑制肾上腺皮质酮向醛固酮的转化，可减少醛固酮的分泌。中毒剂量的喹乙醇能够对鸡肾上腺皮质功能产生抑制性损害，使血浆中醛固酮含量减少，导致低血

3、钠和高血钾，肝微粒体酶系统被抑制，细胞色素P．450酶含量减少，肾排泄功能受损。在长期喂养动物试验中也发现高剂量乙酰甲喹能够导致大鼠肾上腺组织损伤，使血浆皮质酮、醛固酮下降即甾类激素释放失衡及引起水盐代谢紊乱，并引起细胞色素P450酶CYPllBl和醛固酮合成酶CYPllB2下调；在猪离体肾上腺细胞水平上，观察到该类药物能够减少猪肾上腺皮质细胞醛固酮的分泌。本实验室前期研究中也发现喹烯酮对猪离体的肾上腺皮质细胞有毒性损伤，且抑制醛固酮合成及分泌相关酶的表达。有研究表明喹噫啉类药物潜在毒性作用可能与体内的脱氧代谢物有关，因此

4、，对喹噫啉类药物在动物体内代谢物的毒性研究具有重要的意义。本研究主要以人肾上腺皮质细胞NCI．H295R作为离体细胞模型，通过加入喹嗯啉类的脱氧代谢物，筛选主要的毒性代谢物，通过醛固酮合成主要酶的调控表达影响对其毒性作用机制进行更深一步的研究探讨。研究结果发现，喹嗯啉类代谢物对肾上腺细胞具有时间剂量依赖性的毒性，通过对醛固酮激素水平的检测，确定喹嗯啉类药物脱氧代谢物的主要毒性代谢物为N1脱氧代谢物，其毒性大小依次为N1脱氧喹烯酮>N1脱氧乙酰甲喹>N1脱氧喹赛华中农业大学2012届硕士研究生学位论文多，与喹嗯啉类原形药物的

5、毒性大小顺序一致，其毒性代谢物的筛选与其侧链化学式的结构具有一定关系，从而引起肾上腺细胞的毒性损伤。我们也首次发现N1脱氧喹烯酮、N1脱氧乙酰甲喹、N1脱氧喹赛多对肾上腺细胞的毒性损伤与氧化应激密切相关，导致机体脂质过氧化，最终导致细胞氧化还原体系的失衡；不同药物对氧化应激指标的影响能力不同，其氧化损伤程度与其对醛固酮激素的毒性抑制呈正相关。药物作用引起醛固酮合成分泌的抑制，天然氧化应激抑制剂原花青素能够有效提高醛固酮的合成分泌，减缓药物对肾上腺细胞的毒性损伤，减轻药物对细胞的脂质过氧化，减缓药物引起的氧化损伤。喹烯酮主要

6、的毒性代谢物N1脱氧喹烯酮能极显著的抑制转录因子NURRl及ATF．1基因表达水平，以及有效的抑制NGFIB的表达，调控醛固酮合酶CYPllB2基因的表达水平；通过抑制转录因子CREB、SF．1的表达，从而抑制CYPllBl蛋白及基因的表达。N1脱氧喹烯酮通过对转录因子不同的调控能力，从而决定各转录因子与目的基因启动子位点结合能力的强弱，抑制所有转录因子的表达，引起醛固酮合成主要酶CYPllBl、CYPllB2基因和蛋白的表达表达水平的下降，能够显著下调CYPllB2的基因水平，抑制CYPllBl基因的表达，最终导致醛固酮

7、激素分泌的降低。加入氧化应激抑制剂原花青素后，原花青素能显著上调转录因子CREB的表达，以及上调表达转录因子NURRl、NGFIB、ATF．1，提高转录因子与启动子的结合，促进CYPllBl、CYPllB2的转录与表达，提高CYPllBl、CYPllB2基因和蛋白水平的表达，缓解药物对肾上腺细胞的毒性反应，升高醛固酮激素的分泌水平。N1脱氧乙酰甲喹作为乙酰甲喹主要的毒性代谢物，能抑制NCI．H295R细胞醛固酮激素的分泌。一方面，通过抑制CREB及SF．1基因的表达，其中显著抑制SF．1的表达，调控抑制CYPllBl基因及

8、蛋白的表达；另一方面，N1脱氧乙酰甲喹作用于细胞后，极显著的抑制转录因子NURRl、NGFIB、ATF．1基因表达，使得各个转录因子不能与CYPllB2基因启动子上的结合位点充分结合，抑制CYPllB2的表达，进一步使得醛固酮合酶的表达抑制，最终抑制醛固酮激素的合成分泌。原花青素对转录因子NGFIB作用