放射免疫分析技术.ppt

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1、放射免疫分析技术（Radioimmunoassay，RIA）核医学治疗：肿瘤、甲亢等诊断体内——PET、SPECT、放射免疫成像等体外——放射免疫分析（RIA）标记免疫分析技术用标记示踪技术观察抗原抗体一级反应的分析方法特点：敏感性高，反应时间短，可用仪器检测结果三大标记免疫分析技术：放射免疫、荧光免疫、酶免疫检测方法检测范围生化、常规免疫mg~μg（10-3~10-6g）荧光免疫、酶免疫μg~ng（10-6~10-9g）放射免疫、发光免疫ng~pg（10-9~10-12g）PCRpg~fg（10-12~10-15g）一、放射免疫

2、分析技术（Radioimmunoassay，RIA）女科学家R.Yalow（美,1921~）1950’末发明（胰岛素），1977年获诺贝尔医学奖1.基本原理（1）竞争结合分析：Ag+AbAgAb*Ag+Ab*AgAb（2）IRMA（免疫放射分析）：2.常用标记核素：（1）125I：γ射线，半衰期60天（2）3H：β射线，半衰期12.3年3.测量仪器（1）γ计数仪（2）β液闪仪4.基本试剂（1）标准品与质控品a.意义：放射免疫定量分析的尺度、质量控制的依据b.要求：化学结构上——与待测物有相同的化学结构化学纯度上——对竞争反应有

3、干扰的杂质的含量低含量准确注意不变质与降解：在运输、保存时尤应注意；注意有效期c.种类：国际标准、国家标准、企业标准（2）标记物a.对标记物的要求比活度高：即单位物质的放射性强度高生物活性及免疫活性与标记前改变小放射化学纯度高：应>95%稳定性好：标记的同位素不易脱落b.标记方法：氯胺-T法：最常用的125I标记法，I与酪氨酸共价结合，方法简便，但易造成蛋白质的损伤乳过氧化酶法：Iodogen（氯甘脲）法：固相法，标记率较高，损伤小，反应时间长置换法：3H最常用c.标记产物的纯化：常用Sephadex层析，也可用硅胶G薄板层析或H

4、PLC分离d.标记产物的鉴定：常用RIA法最大结合百分率标准曲线比较法e.半抗原的标记：必须先连接载体，常用牛血清白蛋白（BSA），再对载体作标记（3）特异性结合抗体a.对特异性结合抗体的要求：亲和力（affinity）高：指单个抗体分子与抗原决定簇特异结合的能力，用K值表示，反映灵敏度特异性高：与待测抗原的结合力高，而与待测抗原类似物的结合能力（交叉反应）低滴度（效价）高：指结合50%标记抗原时抗体的稀释度高稳定性好：能长期保存，化学性质、效价稳定b.抗体的制备选择合适的免疫动物：兔、鼠、羊应用佐剂：福氏完全佐剂与不完全佐剂（羊

5、毛脂、石蜡油+卡介苗）选择合适的免疫方法：剂量、接种途径（腹股沟、腋窝、脊柱两侧皮内多点）、间隔时间（加强）与次数c.抗体的纯化去除杂抗体：用抗原吸附法提取特异性IgG：先用盐析法粗提，再用离子交换层析或亲和层析纯化d.抗体的鉴定鉴定内容：效价、亲和力、特异性鉴定方法：效价（琼脂单扩）、特异性（琼脂双扩）、RIAe.单克隆抗体的使用：用于IRMA或RIA，特异性高不一定优于传统的多克隆抗体5.竞争性放射免疫分析法的建立（1）反应方式a.平衡法：标记抗原与待测抗原、特异性抗体同时加入温育b.顺序法：先加入待测抗原、特异性抗体温育一段

6、时间后再加入标记抗原。可提高反应灵敏度c.STAT法：反应未达平衡时即测定，较难控制反应条件（2）反应体系a.缓冲液：常用0.05~0.1mol/LpH7.4~7.5磷酸或Tris-HCl缓冲液。根据需要定b.反应体积：小体积可提高灵敏度，但增大了误差c.反应时间：d.反应温度：e.反应物比例：减少抗体与标记的用量可提高灵敏度；增加抗体与标记的用量可扩大测定范围（3）分离方法a.对分离方法的要求：使结合部分（B）与游离部分（F）尽可能分离完全分离后便于放射性测量分离效果不受外界干扰因素的影响操作简便、分离迅速、重复性好与游离标记物

7、的非特异性结合尽可能小试剂来源广泛、价格低廉b.常用的分离方法二抗法：非特异性低，但沉淀较差PEG法：沉淀较好，但非特异性高二抗-PEG法：较好，现常用磁化颗粒法：固相法：现较常用（4）添加剂的问题a.防腐剂：低浓度NaN3对分析的影响小b.抗凝剂：EDTA、肝素对分析无影响c.抑肽酶：对一般分析无影响6.放射免疫分析的数据处理（1）数据处理的基本步骤a.作图法b.数学模型法（2）几种数学模型a.一般多项式函数：普适性差，现基本不用b.直线法：logit-lg转换c.四参数Logistic模型：目前常用7.放射免疫分析的质量控制（

8、1）放射免疫分析中的误差及引起误差的原因a.系统误差：由于某些特定的原因造成的带有倾向性的误差试剂误差：标准品不准；标记物变质；抗体失效；分离剂的影响仪器误差：测量仪器不准；加样器不准分离误差：分离不完全或失误数据处理误差：选用数学模型不当b.随机