放射免疫分析技术1

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1、第七章放射免疫技术第一节　放射免疫技术一、原理及分类二、常用的放射性核素三、标记物制备及鉴定四、抗血清鉴定第二节　放射免疫分析一、基本原理二、实验方法及测定第三节免疫放射分析一、基本原理二、IRMA与RIA的比较思考题小结免疫技术：以抗原-抗体反应原理为基础，对样品中相应抗原或抗体进行检测。标记技术：将可被探测的示踪物质用化学方法与化合物连接。标记免疫分析：用可微量或超微量检测的示踪剂标记抗原、抗体，检测免疫反应结果并确定待检物。标记免疫技术－基本概念常见标记免疫技术放射免疫技术酶免疫技术荧光免疫技术第一节放射免疫技术早期的放射免疫技术

2、是基于竞争性结合反应原理的放射免疫分析(RIA)，稍后又发展了非竞争性结合的免疫放射分析(IRMA)。该类技术具有灵敏度高、特异性强、重复性好、样品及试剂用量少、操作简便且易于标准化等优点，广泛应用于生物医学研究和临床诊断领域中各种微量蛋白质、激素、小分子药物和肿瘤标志物的定量分析，对相关学科的发展起到了极大地推动作用。放射免疫RIA以标记抗原与反应系统中未标记抗原竞争结合特异性抗体来测定待检样品中抗原量。免疫放射IRMA以过量标记抗体与抗原非竞争结合，采用固相免疫吸附载体分离游离和结合标记抗体。放射受体分析RRA(标记受体检测抗原)放

3、射配体结合分析RBA（标记配体研究受体）其它一、放射免疫技术－原理及分类二、放射免疫技术－常用的放射性核素125I(最常用)131I3H14C射线γ（电离辐射弱，对标记物的免疫活性影响小）β（电离辐射强）理化性活泼差核素丰度>90%20%－半衰期约60天8天12.3年标记方法简单复杂标记设备低廉昂贵测量条件简单复杂（晶体闪烁计数仪）（液体闪烁计数仪）常用标记核素核素丰度：类似于纯度概念，代表了某示踪物中具有放射性部分的比例，丰度的高低直接或间接地影响标记产物的比放射性。三、放射免疫技术－标记物制备及鉴定标记物：通过直接或间接的化学反应将

4、示踪物质连接到被标记分子上所形成的化合物。制备高比放射性、高纯度和完整免疫活性的标记物是高质量放免分析的重要条件。125碘-标记物的制备－标记125I-化学或酶促反应，将放射性负电碘离子氧化成碘原子或正电碘离子，通过取代反应置换被标记物分子中酪氨酸或酪胺残基以及组胺残基上的氢原子。125I或125I+125I-标记物（混合物）Ch-T、LPO氧化取代反应直接标记法三、放射免疫技术－标记物制备及鉴定使用无还原剂的高比放射性碘源被标记物用量要少ch-T用量要低控制总反应体积<200μl反应时间1-2分钟弱碱性反应条件乳过氧化物酶（LPO）标

5、记法：LPO催化H2O2释放活泼的新生态氧，后者使125I-活化成125I2/125I+而取代被标记物分子中暴露的酪氨酸残基苯环上的氢原子。该法反应温和，可减少对被标记物免疫活性的损伤；酶活性有效期不长，稀释后即可终止反应，易于控制被标记物上125I的数量。间接标记法联接标记(bolton-Hunter)预先将125I用ch-T法标记琥珀酰胺酯，制成的125I化脂功能基团可与蛋白分子上的氨基酸残基反应，从而使待标记物被碘化。bolton-Hunter优点；不足之处是标记物的添加基团可能影响被标记物的免疫活性125碘-标记物的制备－纯化凝

6、胶过滤法离子交换层析法聚丙烯酰胺凝胶电泳高效液相色谱法聚合、损伤物标记蛋白游离125I如标记反应混合液过葡聚糖凝胶G50柱层析，定时/定量逐管收集层析洗脱液，合并标记物峰洗脱液，加入蛋白稳定剂后，分装低温保存。由于脱I-及自身辐射造成蛋白破坏形成碎片等，贮存一定时间后需重新纯化。125碘-标记物的制备－鉴定标记物质量高比放射性高纯度完整免疫活性放射化学纯度单位标记物中结合于被标记物上的放射性占总放射性的百分率（AcCL3/ALB沉淀所有蛋白，沉淀物放射性占待测样品总放射线的百分率）应大于95%也是观察标记物脱碘程度的重要指标免疫活性标记

7、物与抗体结合的能力标记物与过量抗体反应，与抗体结合的标记物的放射性与加入标记物的总放射线的百分比该值越大,标记物免疫活性好，应大于80%反映被标记物免疫活性受损情况比放射单位化学量标记物中所含的放射性强度，也可理解为每分子被标记物所挂放射性原子数目单位：Ci/gmCi/mgCi/mmol比放射性过高，将影响标记物免疫活性，因为辐射自损伤大。计算法：依据标记反应中放射性核素的利用率（标记率）来计算标记物的比放射性.自身置换法：比较标记抗原与标准抗原的免疫活性来测定标记物的比放射性结果准，测定复杂比放射性－计算法结果欠准，计算简便自身置换曲

8、线反应系统：限量Ab和递增剂量(cpm)的标记抗原标记抗原的结合率(B/T%)随标记抗原总量的增加而减少若标记抗原与标准品抗原具有相同的免疫活性，两条曲线平行标准曲线反应系统:抗体（限量）、标记抗原（定量）