放射免疫分析.ppt

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1、第三章放射免疫分析技术体外放射分析技术利用放射分析方法或其派生的相关技术在体外进行体内物质种类和含量的分析测定。竞争性放射分析——放射免疫分析（RIA）非竞争性放射分析——免疫放射分析（IRMA）待测物质浓度与检测手段临床化学分析10-1210-910-610-310-0pg/mLng/mLmg/mLmg/mLg/L免疫分析TherapeuticDrugsThyroidHormoneFertilityHormoneAllergyCancerMarkersInfectiousDiseaseVitamins

2、SerumProteins第三章放射免疫分析放射免疫分析法免疫放射分析法临床应用放射免疫分析的创立1959美国Yalow&Berson1960英国Ekim’s1977获诺贝尔医学生物学奖医学生物学超微量分析的里程碑1959年，Yalow和Berson创立了放射免疫分析法（RIA），并因此于1977年获得诺贝尔生物医学奖。这种方法结合了放射性核素测量的高灵敏性和免疫抗原-抗体反应的高特异性两大特点，开创了生物活性物质微量测定技术的先河。女科学家R.Yalow放射免疫分析法（Radioimmunoassa

3、y，RIA）基本原理Ag+AbAg-Ab+Ag*Ag*-Ab竞争结合：放射性标记的抗原（Ag*）和非标记的抗原（Ag）在同一反应系统中与特异性抗体（Ab）的竞争性结合。在上反应式中：Ag与Ag*的免疫活性相同，即与Ab有相同的亲和力；Ab的结合位点数＞Ag或Ag*，但＜Ag+Ag*；Ag*与Ab的量是恒定的，Ag是待测量。二种抗原(Ag、Ag*)与Ab结合的量取决于两者的浓度比例，Ag量多，则AgAb结合多，Ag*Ab结合量就少，即Ag*Ab将随Ag的增加而减少，呈负相关，表现为函数关系。在系统中，Ag

4、*Ab的量可通过测定放射性而获得，再根据函数关系求Ag的量。++++++++BoundFreeAgAb标准曲线标准曲线又称为剂量反应曲线，以一系列递增浓度的Ag及一定量的Ag*与恒定量限量的Ab竞争结合反应而得，是对待测物进行定量分析的基础。标准曲线实例标准曲线:①配制一系列已知浓度的标准抗原，分别向其中加入固定量的标记抗原和抗体，反应平衡后，分离抗原的结合部分和游离部分，测定*Ag-Ab的放射性B。②B0为标准抗原浓度=0时的放射性值。放免分析基本条件（一）标准抗原（二）特异性抗体（三）标记抗原（四）

5、分离技术a.概念：是指已知真实含量，且不含对免疫反应产生干扰杂志的抗原。b.用途：免疫动物制备抗体——Ab放射性核素标记——Ag*绘制剂量反应曲线c.要求：高纯度高准确度良好的稳定性（一）标准抗原（二）特异性抗体a.对特异性结合抗体的要求：1．亲和力（affinity）高：指单个抗体分子与抗原决定簇特异结合的能力，用亲和常数Ka值表示，反映灵敏度，Ka应达109~1012mol/L。2．特异性高：与待测抗原的结合力高，而与待测抗原类似物的结合能力（交叉反应率）低。3．滴度（效价）高：指将血清稀释时能与抗

6、原发生反应的最高稀释度。它反映抗血清中有效抗体的浓度。稀释倍数越高，滴度(titer)越高，表示抗体的效价越高。4．稳定性好：能长期保存，化学性质、效价稳定。b.抗血清的制备：1.大分子物质可直接免疫动物诱导抗体产生，但是小分子物质为半抗原，必须与载体结合制成人工抗原（半抗原-蛋白质），才能进行免疫。2．选择合适的免疫动物：兔、鼠、羊。3．应用佐剂：福氏完全佐剂与不完全佐剂（羊毛脂、石蜡油+卡介苗）。4．选择合适的免疫方法：剂量、接种途径（腹股沟、腋窝、脊柱两侧皮内多点）、间隔时间（加强）与次数。c.单

7、克隆抗体的使用：特异性高亲和力低，不一定优于传统的多克隆抗体对标记抗原的要求：1．放射性比活度高：即单位物质的放射性强度高，一般至少达到370GBq/mmol。2．免疫活性：与标记前一致。3．放射化学纯度高：应>95%。4．稳定性好：标记的同位素不易脱落。（三）标记抗原常用标记核素：（1）125I：γ射线，半衰期60天（2）3H：β射线，半衰期12.3年测量仪器：（1）γ计数仪（2）β液体闪烁计数器两种标记方法的优缺点3H标记物125I标记物货架期长货架期短以3H置换H，对原物质以125I取代H，可能影

8、响免疫活性无改变免疫活性标记难度大，比活度低标记方法简单，比活度高Β射线测量效率低γ射线测量效率高废弃物处理较困难废弃物处理较容易a.对分离方法的要求：1．使抗原-抗体复合物（B）与游离抗原（F）尽可能分离完全；2．分离后便于放射性测量；3．分离效果不受外界干扰因素的影响；4．操作简便、分离迅速、重复性好；5．与游离标记物的非特异性结合尽可能小；6.试剂来源广泛、价格低廉。（四）分离技术b.常用的分离方法1.双抗体法特点：分离完全，非特异结