同济大学医学院生命科学综合实验小论文

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1、摘要miRNA的特点:MiRNAs具有高度的保守性、时序性和组织特异性。MiRNA表达的时序性和组织特异性提示人们miRNA的分布可能决定组织和细胞的功能特异性，也可能参与了复杂的基因调控，对组织的发育起重要作用。本次试验用分子克隆的方法构建带有shRNA的pSuper载体经双酶切后电泳检测，并进行质粒DNA的抽提纯化和鉴定；用DNA-磷酸钙沉淀介导的转染法转染293细胞，经MTT、RT-PCR、Westernblot检测所获得的细胞株，构建含有人工合成shRNA与pSuper的载体，并将其转入人胚肾

2、细胞中（293细胞），进一步观察shRNA的功能。结果：1.成功构建了含有shRNA的pSuper载体，经酶切鉴定，结果显示构建正确；2.获得了转染成功的293细胞；3.正确解释microRNA-X的功能。结论：本研究成功构建了含有shRNA的pSuper载体，并成功转进人胚肾293细胞，有效抑制相应蛋白的表达。关键词：，pSuper载体，，microRNA-X，RT-PCR目录一引言（含miRNA相关资料）二MicroRNA-X的克隆及其功能分析1材料和方法2结果和讨论三结论一引言microRNA-

3、X是近几年新发现的一类不编码蛋白质的单恋小分子RNA，这种小分子RNA通过互补配对原则作用于mRNA，由此影响蛋白质翻译过程引起基因沉默，其作用体现为在转录后水平对基因表达进行调控。microRNA-X最为21世纪生命科学研究最为重大的发现，已经在短时间内成为了世界顶尖科学家研究的焦点，并迅速取得了另人瞩目的进展，短短几年关于microRNA-X的研究报道已近2000片。microRNA-X干扰这种独特的方式影响着生命活动中诸多方面，包括肿瘤的仿生、发展、耐药；胚胎的分化、发育；细胞的掉网；细胞抗病毒

4、感染等方面。我们的实验应用了基本生物信息学、基本的分子生物学实验技术和基本的细胞生物学实验技术，完成基因克隆和表达的完整工作。microRNA-X的克隆与功能分析包括5个连续的实验：一、人工合成shRNA与pSuper载体的体外链接与转化；二、质粒DNA的抽提与鉴定；重组质粒DNA序列测定三、转染真核细胞；MTT法检测对细胞活力的影响；四、RNA的抽提纯化及逆转录PCR扩增目的基因五、Westernblot对特定蛋白表达的检测特定基因克隆的获得是研究其功能的前提。重组质粒经测序验证后经过质粒抽提，进行

5、转染真核细胞，基于本实验涉及的质粒pSuper带有EGFP标记，可以在荧光显微镜下观察转染效率，通过MTT实验检测MicroRNA-X对过表达细胞活力的影响；通过RT-PCR检测MicroRNA-X对其特定靶基因的表达调控；进一步在蛋白质水平通过Westernblot进行验证。二MicroRNA-X的克隆及其功能分析1材料和方法材料：细胞株人胚肾293细胞质粒和菌株pSuper载体和E.coliDH5α分子克隆及转染试剂限制性内切核酸酶连接酶试剂盒LB固体/液体培养基质粒抽提试剂盒Lipofectan

6、min2000MTTDMSOBiowit钙转试剂盒细胞培养试剂DMEM-HG小牛血清胰酶EDTA100*双抗RT-PCR实验试剂无RNA酶水Trizol试剂氯仿、异丙醇、无水乙醇甲醛变性电泳缓冲液RNA电泳用加样缓冲液逆转录反应试剂盒dNTPmix、RNaseInhibitor、PCRkit试剂盒、oligoDt电泳缓冲液5×TBESDS聚丙烯酰胺凝胶电泳及Western-印记法试剂PMSF(苯甲基磺酰氟)SDS（十二烷基磺酸钠）丙烯酰胺N,N,-亚甲基甲叉双丙烯酰胺TEMED(N,N,N,N-四甲基

7、乙烯二胺)溴酚蓝（BPB）碱性磷酸酶标记羊抗鼠β-ActinPVDF膜分子量标准蛋白BCA蛋白测定试剂盒方法：人工合成shRNA与pSuper载体的体外连接于转化1）实验室已经提供双酶切的质粒载体2）载体与shRNA的连接3）感受态细胞制备与转化质粒DNA的抽提纯化、鉴定和测序抽提纯化1）柱平衡步骤：向吸附柱CAI中加入500µl的平衡液BL，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。2）将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下放入干净的离心管中，称取重量。3）向胶块中

8、加入3倍体积溶胶液PN，50℃水浴放置10分钟，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。4）将上一步所得溶液加入一个吸附柱CAI中，室温放置2分钟，12000rpm离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。5）向吸附柱CAI中加入600µl漂洗液PW，使用前先检查是否已经加入无水乙醇，12000rpm离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。6）向吸附柱中加入600µl漂洗液PW，12000rpm离心