高产谷胱甘肽酵母菌株的选育和培养条件的初探（ X页）.doc

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1、高产谷胱甘肽酵母菌株的选育和培养条件的初探摘要：以SaccharomycescerevisiaeGJ96-2为岀发菌株，通过紫外线照射结合乙硫氨酸平板筛选，连续两代诱变筛选分离得到高产突变株SaccharomycescerevisiaeSE-2：摇瓶试验胞内谷胱廿肽含量达到2.2%,较出发菌株G796・2提岛62.9%,传代试验表明其遗传性能稳定。对SE・2的培养条件进行了研究。采丿I］正交化实验和双碳源实验对培养基进行优化，结果表明，最佳初糖浓度6%,葡萄糖/糖蜜=3.5:1,半胱氨酸的添加浓度5mmoLL-1较为适宜。在优化的

2、培养条件下培养39h,SE-2谷胱肽总量达180mgL-l以上较G796-2提高8L2%。1前言谷胱廿肽，Y厶谷氨酰厶半谷氨酰■廿氨酸(Y-L-glutamyl-L-cystcinyl-glycinc,简称GSH)是一种广泛存在于动植物和微生物细胞屮具有多种生理功能的三肽［1］。发酵法生产GSH就是选育(或构建)GSH合成能力强和胞内含量高的微生物、筛选和优化培养基配方、建立和优化发酵控制策略、改进和捉高下游过程技术等，最终提高GSH的产率和质量［2］。Sakato等［3］采用先进的YEWPACKINSTRMENTATIONSYS

3、TEM控制系统发酵介成GSH。林建平等［4］利用啤酒废酵母合成GSH。采用发酵法生产GSH的关键，是获得性能优良的高产菌株。本课题组选用产GSH酵母菌株，经过两代紫外线诱变，乙硫氨酸耐性平板筛选，得到GSH含暈更高的突变株，并对该突变株的培养条件进行研究。2材料与方法2.1实验材料2.1.1菌种酿酒酵^(Saccharomycescerevisiae)^株，本实验室保存菌株。2.1.2培养基：1)斜而与平板培养M(gL-')：麦芽汁10；酵母粉3；蛋白月东5；葡萄糖10：琼脂20。2)摇瓶筛选培养基(gL"1)：葡萄糖30；酵母粉

4、6；(NH4)2HPO43：K2HPO41:KH2PO41；MgSO40.8：CYS0.2；ATP0.2。3)摇瓶发酵培养基(gLH)：葡萄糖60；酵母粉12；(NH4)2HPO46；MgSO44.8：K2HPO41:KH2PO41：FeSO40.008；MnSO40.008；ZnSO40.008：玉米浆24；糖蜜17：麦汁30。2.2实验方法2.2.1培养和分析方法从活化斜面上挑取一环菌体接入摇瓶筛选培养基，装量为50mL/250mL二角瓶，置摇床170r-min】，30°C培养39h。而发酵培养则是将24h种子液以10%的接种

5、量，接入发酵培养慕，装量50mL/250mL三角瓶，置摇床170r-min'1,3(TC培养24h。GSH含量测定方法:四氧喀睫法⑸。2.2.2诱变和筛选方法从活化斜面上挑取一环菌体接入液体培养基，置摇床170rmin*,3(TC培养16h,4000rmin1离心收集菌体，以0.85%生理盐水洗涤，稀释制得IO?个细胞mL】菌悬液。取5mL菌悬液置于肓径9cm无菌平皿屮，用紫外灯(功率15W,距离30cm)照射180s,将照射后菌液用0.85%生理盐水稀释10°倍，吸取0.2mL涂布含0.3%氯化锂，lOOpgmL-1乙硫氨酸筛选

6、平板。30°C培养4〜6天，挑选菌落进行筛选。第二代诱变就是将第一代诱变筛选出的高产菌株作为出发菌株，如上述条件培养，诱变，稀释，吸取0.2mL涂布含0.3%氯化锂，300ggmL-1乙硫氨酸筛选平板。30°C培养4〜6夭，挑选菌落进行筛选。从筛选平板上挑取一定数量的抗性突变株至斜面培养基，培养2〜3天后将菌株接入摇瓶筛选培养基，培养39h后测定GSH含暈。挑取GSH含暈提高的高产菌株进行复筛。复筛就是将初筛的较好的菌种，按每株3瓶，培养39小时后测GSH胞内含量，确定高产菌株。3结果与讨论3.1菌种诱变筛选将待筛选的8株酵母菌接

7、入摇瓶培养基培养，其屮G796-2的胞内含暈最高，为1.35%,产暈达39陀丄匕作为诱变的岀发菌株。对G796-2菌株进行紫外诱变后，涂布筛选平板，初筛得到高产突变株共17株，然后对这17株进行复筛，测定GSH含量，结果见表1°表1第一代诱变高产突变株复筛Table1RescieeningofGSH-high-yieldingmutantinthefirstgenerationNumberofstrainGSH/mg-L"1GSH/%NumberofstrainGSH/mg-L'1GSH/%G796-239.16±1.50135B

8、U-945.26±2.401.57BU-145.23±2.201.55BU-105384±1.20140BU-250.56±1.701.68BU-1156.36+2.201.54BU-341.72±l,801.39BU-1255・76±2・3016