高效液相色谱-同位素稀释质谱法定量分析人生长激素.pdf

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1、第43卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第7期2015年7月ChineseJournalofAn~icMChemistry1016～1020DOI：10．11895／j．issn．0253~820．150066高效液相色谱．同位素稀释质谱法定量分析人生长激素金有训石莲花武利庆刘文丽王晶(中国计量科学研究院，北京100013)摘要建立了人生长激素(hGH)纯化分析和高效液相色谱(HPLC)与同位素稀释质谱(IDMS)联用高准确度绝对定量方法。采用快速蛋白液相色谱来分离纯化hGH，以傅里叶变换离子回旋共振质谱仪(FTICR．MS)准确地测定蛋白质的分子质量。纯化的

2、hGH经酸水解后，采用KINETEXC色谱柱为分析柱，以水(含0．1％三氟乙酸)和乙腈为流动相，等梯度分离，流速0．2mL／min，温度40~C，采用电喷雾正离子模式进行电离，选择多反应监测模式进行检测，内标法定量分析。结果表明。FTICR．MS所测得的分子量实测值与理论值仅相差0．31Da，脯氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸在液相条件下5rain内达到基线分离，在最优条件下，hGH含量测定结果为186．80g，相对标准偏差为0．52％。利用本方法参加国际比对，比对结果与参考值等效一致。本方法具有简易、实用的特点，并且准确可靠，可作为hGH纯品标准物质的定值方法，为hGH的日常检

3、测提供参考。关键词人生长激素；高效液相色谱；同位素稀释质谱法；傅里叶变换离子回旋共振质谱仪；定量分析1引言人生长激素(Humangrowthhormone，hGn)是由脑垂体前叶嗜酸性细胞分泌的蛋白质，是一种肽类激素，是诊断巨人症、肢端肥大症、遗传性生长激素生成缺陷所致的生长激素缺乏症最常用的指标[1]。目前，临床检验中针对重组hGH(rhGH)的检测方法有酶联免疫法_2I3j、时间分辨荧光免疫分析法]、LC．MS／MS法[5．6]、毛细管电泳结合紫外和质谱技术_7]也为检测rhGH滥用后的浓度的差异提供了新途径。但这些方法都是相对测定法，耗时长、费用高、操作复杂。因此

4、，亟需建立具有操作简单，高准确度和高精密度hGH的参考测量方法。目前，纯蛋白的定量方法主要有氨基酸分析[、质量平衡[引、定量核磁引、质谱法[”以及同位素稀释质谱法_l'n]。氨基酸分析法一般在氨基酸分析仪上通过紫外或荧光检测，因此易受干扰。操作比较复杂；质量平衡法虽然具有高准确度，但其在标准物质定值方面具有一定的局限性；定量核磁法具有无需待测物对照品、样品预处理步骤简单、测定快速准确、专属性强、不破坏样品等优点。但灵敏度较低；同位素稀释质谱法具有操作简单，高准确度和高精密度的特点[1。本研究采用快速蛋白液相色谱分离纯化hGH，再采用SDS—PAGE和超高分辨能力FTIC

5、R对hGH进行纯度表征和分子量测定，为蛋白质结构的鉴定奠定基础。采用KINETEXC色谱柱在5min内快速分离3种氨基酸(脯氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸)。本方法具有操作简易、分析速度快、重现性较好、实用性强等特点，并且准确可靠。以此为基础建立了hGH的HPLC．IDMS联用高准确度绝对定量方法。2实验部分2．1仪器、试剂与样品Qtrap5500(美国AB公司)；Agilent1200(美国安捷伦公司)；垂直电泳槽(美国伯乐公司)；AKTApurifier(美国GE公司)；12T—FTICR高分辨率质谱仪(美国Bruker公司)；ME235S型天平(感量0．01mg，德国Sa

6、tofius公司)；RC10-22T型离心干燥机(美国Thermo公司)；UFE500烘箱(德国Mem．mer【公司)；移液器(10，20gL，100gL，200gL，1000，法国Gilson公司)；美国Milli．Q超纯水系统。标记氨基酸(c5-脯氨酸、"C．缬氨酸13C9-苯丙氨酸，美国剑桥同位素实验室)；脯氨酸(GBW(E)2015~1-21收稿；2015-04-28接受本文系中国计量科学研究院国际比对专项项目(201325)资助E—mail：jinyx@nim．ac．an第7期金有训等：高效液相色谱一同位素稀释质谱法定量分析人生长激素1017100084，Pr

7、o)、缬氨酸(GBW(E)100055，Va1)、苯丙氨酸(GBW(E)100061，Phe)国家标准物质(中国计量科学研究院)；hGH(安徽安科生物工程股份有限公司)；三氟乙酸(TFA，中国DikmaPure公司)；乙腈(美国J．TBaker公司)；蛋白质预制胶(7×8em，胶厚1．0mm，美国伯乐公司)；10xSDS缓冲溶液(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)；彩虹预染宽分子量蛋白Marker(10260kDa，中国中科瑞泰公司)；其它试剂均为分析纯。实验用水为Milli—Q超纯水。2．2hGH纯化将1mghGH溶于1mL水中，经0．