高效液相色谱柱后同位素稀释质谱法定量研究人血清中转铁蛋白和白蛋白

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1、高效液相色谱柱后同位素稀释质谱法定量研究人血清中转铁蛋白和白蛋白　　摘要建立了高效液相色谱（HPLC）与电感耦合等离子体质谱（ICPMS）联用，同时结合柱后同位素稀释法，通过直接测定硫及铁元素，实现蛋白质绝对定量的分析方法。选取分子量不同的4种标准蛋白：转铁蛋白、β乳球蛋白、肌红蛋白和溶菌酶作为混合蛋白，34S或54Fe同位素稀释剂与液相色谱洗脱液经三通混合后，在线进入ICPMS检测。根据同位素稀释法公式及蛋白中硫、铁的含量计算混合蛋白中每种蛋白的浓度，与天平称量结果一致，对方法进行了验证。将方法应用到人血清转铁蛋白、白蛋白的定量分析，针对两种蛋白含量差别大导致的信

2、号差异，通过改变同位素稀释剂的流速，成功测定了人血清中转铁蛋白、白蛋白的含量。采用34S及54Fe同位素稀释剂分别定量的血清中转铁蛋白浓度为（2.35±0.01）g/L和（2.22±0.13）g/L，结果基本吻合。方法精密度RSD均小于10%，可用于基体样品中含硫蛋白及金属蛋白的定量分析。关键词同位素稀释；蛋白质定量；电感耦合等离子体质谱；转铁蛋白；白蛋白1引言7蛋白质组学的快速发展，不但需要准确鉴定蛋白质，还要求对处于动态变化的蛋白质进行定量分析[1～4]。目前比较成熟的定量方法多是基于稳定同位素标记的生物质谱[5，6]，但是生物质谱的信号响应与蛋白质或肽段含量间

3、的关系十分复杂，没有蛋白质标准作归一化处理，很难对蛋白质或肽段定量。与生物质谱不同，电感耦合等离子体质谱（ICPMS）分析中元素的响应与原子所处的分子环境无关[7]，而且样品处理简单，易于色谱联用，可进行同位素分析[8]。因此，利用ICPMS对蛋白质中的元素定量分析，是近年来蛋白质定量技术研究的热点。硫是最适合作为蛋白质定量分析的元素[9]。根据SwissProt蛋白质数据库的统计分析，分别有96.6%、98.8%的蛋白质含有半胱氨酸、甲硫氨酸等含硫氨基酸[10]。如果蛋白质的氨基酸序列已知，就能确定其中的硫原子数；那么通过ICPMS测定硫的含量来实现蛋白质的定量是

4、完全可行的[11]。但是，目前ICPMS直接测定硫来定量的蛋白，主要是标准蛋白，涉及基体样品的很少，因为ICPMS测量硫存在一些困难：需使用碰撞池技术或高分辨ICPMS克服O+2对硫的谱线干扰[12]。常见的ICPMS对蛋白质定量研究集中在金属蛋白上[13，14]，定量原理与含硫蛋白相同。7为保证定量分析的准确度，需使用与待测蛋白匹配的标准物质来保障质控与量传，但由于蛋白质种类繁多、结构复杂，目前可获得的蛋白标准十分匮乏。同位素稀释法（ID）是国际公认的具有权威性化学计量方法，只需硫或金属的浓缩同位素即可实现不同基体蛋白的定量分析[15]。高效液相色谱（HPLC）的

5、同位素稀释法分为特异性、非特异性形态[16]。前者在前处理时就将稀释剂加入到样品中，具有传统同位素稀释法的优点；但是必须开发针对目标蛋白的特异性稀释剂制备方法，目前商品化或人工合成的稀释剂非常有限，直到2005年才有文献报道第一次应用到蛋白质的定量分析[17]。而非特异性形态同位素稀释（也称柱后同位素稀释）对蛋白质的种类、结构没有要求，同位素稀释剂常为某元素的简单离子，基本都有商品化的产品，适合于蛋白质的定量分析。目前，文献报道了高效液相色谱柱后同位素稀释质谱法（HPLCIDICPMS），通过测硫定量标准蛋白[11]和测铁定量转铁蛋白[14]，但是未见对硫、铁共同定

6、量蛋白的比较及人血清中多种蛋白的定量。本研究采用液相色谱分离混合蛋白，ICPMS测硫、铁分别定量的标准蛋白结果与天平称量结果比较，验证了HPLCIDICPMS方法，并对硫、铁定量分析进行比较。在此基础上，将方法应用到人血清中转铁蛋白、白蛋白的定量分析，测定了血清中两种蛋白的含量。本方法体系可应用在食品安全、环境监测、临床检验的化学计量、相关实验室认证等生命科学研究的重要领域，促进我国生命科学测量水平的不断提高和测量溯源性研究的深入发展。72实验部分2.1仪器、试剂与样品Element2扇形磁场电感耦合等离子体质谱仪（美国ThermoFisherScientific公

7、司）；高效液相色谱系统（日本Shimadzu公司）：含LC30AD泵、LC20AD泵、SIL30AC自动进样器、CTO20A柱温箱、SPD20A紫外检测器；Toledo型电子天平（瑞士Mettler公司）；MillQ超纯水系统（美国Millipore公司）；TSKGelG3000SWxl凝胶柱（300mm×7.8mm，日本Tosoh公司）；ShodexQA825IEC色谱柱（75mm×8.0mm，日本Shodex公司）Tris、人血清转铁蛋白Transferrin（Tf，75.2kDa，每分子含47个S原子）、白蛋白Albumin（Alb，66.4kDa，含41