超声萃取-同位素稀释液相色谱-质谱法检测血清中氢化可的松.pdf

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1、第41卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究简报第9期2013年9月ChineseJournalofAnalyticalChemistry1439~1443DOI:10.3724/SP.J.1096.2013.30215超声萃取.同位素稀释液相色谱-质谱法检测血清中氢化可的松周剑王敏汤晓艳毛雪飞戴新华(中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所/农产品质量与食物安全重点开放实验室,北京100081)(中国计量科学研究院化学所,北京100013)摘要建立了液相色谱一质谱检测血清中氢化可的松含量的方法。血清加内标后平衡30min,加乙腈除蛋白,将混合液超声10min,再以3000

2、r/min离心15min,取出上清液用氮气吹干,用水复溶后,以相同体积乙酸乙酯萃取两次,将两次萃取的乙酸乙酯合并,氮气吹干,然后用200流动相复溶,液相分离采用ZorbaxEclipsePlusC.色谱柱,流动相为甲醇和含0.1%甲酸的水溶液(43:57,V/V),日间和日内标准偏差分别为0.3%~0.7%和0.3%~0.6%,回收率为99.6%~101.0%,定量限为1.68g/kg。运用本方法检测了3种人体血清中氢化可的松含量,并研究了血清中氢化可的松的稳定性。关键词氢化可的松;同位素稀释;液相色谱一质谱;超声萃取;血清1引言氢化可的松是一种重要的肾上腺皮质激素11,在体液

3、循环中大部分与蛋白质键合。其主要参与碳水化合物代谢,具有阻碍周围组织中蛋白质合成和促进免疫力的功能J,同时参与控制人体新陈代谢速率和个体生长。异常的氢化可的松含量会导致多种疾病,比如阿狄森氏病、库氏综合症和糖尿病等j。因此准确测量血清中氢化可的松含量对于监测甾体激素的产生过程和人体健康有重要意义。关于血清中氢化可的松检测的方法很多,早期主要采用免疫分析法,但测量结果假阳性偏多_6]。近年,大量关于使用液相色谱(LC)-91,气相色谱.质谱(GC—MS)¨U'“和液相色谱一质谱(LC—MS)¨,”的分析方法多有报道。多运用固相萃取(SPE)去除蛋白,分离血清中目标物,取得了一定的

4、效果,但是这些方法往往前处理时间较长,实验消耗昂贵,而且需要较高的实验技巧。为了解决这些缺点,本研究采用超声结合乙酸乙酯液液萃取的方法分离血清中氢化可的松。超声波是一种特殊形式的能量,其在溶液中产生的冲击波和微热流能显著增加待分析物的活性,多用于药物分析,但用于血清中激素的分析还未见报道。同位素稀释质谱法是指将目标物的同位素标记加入待测样品中,与目标物充分混合,通过加人的标记的量及质谱检测的目标物及其同位素标记的丰度比来计算目标物含量的方法。在目标物与其同位素标记达到平衡后,同位素的丰度比既已恒定,混合后的样品在进行元素分离、浓缩、转移、萃取等操作过程中,即使发生丢失,也不会改

5、变同位素组成,避免了由此带来的测量误差。本实验表明,超声萃取可增加氢化可的松从蛋白和血清中分离效果,使用超声波结合液液萃取,大大降低了实验消耗,缩短了前处理时间,经过同位素稀释,进行液相色谱质谱分析,方法准确可靠。2实验部分2.1仪器与试剂6410三重串联四极杆质谱仪(美国安捷伦科技有限公司);氮吹仪(美国Organomation公司);Mil1.QAcademic纯水处理系统(法国MilliPore公司);CP324S电子天平(德国Sartorius公司);台式高速冷冻离心机(德国Sigma公司);TouchMixerMT一51涡旋振荡器(日本Yamato公司);Branso

6、n5510超声波清洗机(美国Branson公司)。甲醇、乙腈、乙酸乙酯(液相色谱级,德国Merck公司),甲酸(分析纯,美国Sigma公司),高纯水2013-03.11收稿;2013-05.13接受本文系中国农业科学院基本科研业务费预算增量项目(No.2013ZL004)资助E—mail:wangmincaas@126.con1440分析化学第41卷(Millipore,17.9Mr/·cm),CSPE柱(美国Waters公司),氢化可的松标准品(纯度99.5%±0.5%,德国Dr.Ehrenstorfer公司),氢化可的松同位素标记标准品(纯度I>98%,英国剑桥实验室),冰

7、冻血清样品,早上8点早餐前从健康人和肾病病人志愿者收集(由国家临床检验中心提供,一8O℃冰冻保存),CCQM—K63a比对样品:正常人冰冻混合血清(国际物质量咨询委员会提供)。2.2液相色谱条件及质谱条件2.2.1液相色谱条件安捷伦1200高效液相色谱仪,ZorbaxEclipsePlusCx8色谱柱(150ram~2.1mmi.d.,3.5m);流动相A为甲醇,流动相B为0.1%甲酸溶液,两相比例为43:57;柱温:25℃;样品盘温度:4℃;流速为0.25mL/min。2.2.2质谱条件安

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