基于-1HNMR的代谢组学方法对大鼠砒霜给药后血清的研究.pdf

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1、第41卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究简报第9期2013年9月ChineseJournalofAnalyticalChemistry1434～1438』)DOI：10．3724／SP．J．1096．2013．21227《研究简报》(e：；；基于HNMR的代谢组学方法对大鼠砒霜给药后血清的研究张盼盼章文军薛蓉李晓晶闰威。裴奉奎(河北工业大学化工学院，天津300130)(中国科学院长春应用化学研究所，长春130022)(长春中医药大学附属医院，长春130021)摘要运用代谢组学方法研究了Wistar大鼠灌胃给药砒霜2和10ms／kg剂量血清代谢的

2、变化。通过核磁共振技术检测大鼠血清的代谢指纹图谱，然后利用主成分分析法分析空白组和砒霜给药组的代谢物差异，研究不同剂量砒霜在大鼠体内的急性生物效应。结果表明，砒霜对大鼠的急性靶向器官是肝脏，随着剂量增大，毒性增强；低剂量给药导致氧化应激，高剂量给药诱导细胞凋亡；低和高剂量给药均出现糖、氨基酸及脂质代谢紊乱，且能量代谢异常。关键词代谢组学；砒霜；核磁共振；血清；主成分分析1引言1999年，Nieholson等提出代谢组学(Metabonomics)的概念，并将其定义为：对生物系统因病理生理或基因改变等刺激所致动态多参数代谢应答的定量测定J。如今，代谢组

3、学已应用于疾病诊断、药物毒性、营养学等多个领域J。代谢组学方法主要利用现代分析技术如Gc．Ms，Lc．Ms，HRMAS和‘HNMR等，结合模式识别方法，对生物体液和组织进行系统检测和分析，从而得到生物体代谢物浓度随时问变化的信息。。’。砒霜为临床上应用广泛的矿物药，主要成分是As0及一些矿物质，主要用于治疗寒痰哮喘、疟疾、梅毒和痔疮等疾病。但研究表明，砒霜既能治疗急性早幼粒细胞白血病j，又能诱导体内外的肿瘤细胞株凋亡_9'm；同时，As0是一个活性很高的分子，能与很多蛋白的巯基结合，对线粒体产生毒性作用，消除细胞膜电位，产生活性氧物质(Reactiv

4、eoxygenspecies，ROS)。砒霜进人人体后能破坏某些细胞呼吸酶，强烈刺激胃肠粘膜、破坏肝脏，严重的会导致呼吸和循环衰竭。As㈣被认为是毒性物质和致癌物，但对其毒性评价还不完全。主成分分析是毒性评价中常用的模式识别方法之一，利用它对体液HNMR谱图数据进行处理和分析，能得到有价值的生物信息。本研究利用主成分分析法和基于HNMR的代谢组学方法¨，从分子水平对砒霜毒性和毒性作用机制进行研究。2实验部分2．1动物实验雄性Wista大鼠由吉林大学基础医学院提供，为保证取样的平行程度，大鼠饲养昼夜节律，自由摄食饮水，环境温度保持在(23+_2)oC，

5、湿度(55±5)％RH。选取体重(250+20)g成年大鼠4O只，随机等分成2批，每批随机等分成4组：对照组、48、96和168h给药组。大鼠在代谢笼内适应7d，分别一次灌胃给药2和10mg／kg体重剂量的砒霜。血清收集：给药组分别在给药48、96和168h后断头取血，对照组在168h后断头取血。血液于4℃下静置1h后，以4000r／min离心10min，上层血清于_20℃保存。2．2核磁共振测试将血清解冻，取0．4mL血清于离心管中，加入0．2mL缓冲溶液(0．2mol／LNa2HPO／0．2mol／L2012—12-06收稿；2013-04-08

6、接受本文系国家自然科学基金(No．20975097)资助项目}E—mail：xjli@ciac．ac．cn第9期张盼盼等：基于HNMR的代谢组学方法对大鼠砒霜给药后血清的研究NaH，PO，pH=7．4)及0．06mLD20，于4cC下静置10min后，以4000r／min离心10rain。取0．55mL上清液于5mmNMR样品管中于25℃进行测试，HNMR谱图在BrukerAV600型仪器上测试。血清采用CPMG自旋回波序列结合预饱和方法采集信号，FID采样次数64，数据点16k，延迟时间6S，90。偏转角。采样时间为0．911S，谱宽8992．8H

7、z。2．3血清样本的HNMR数据处理使用MestRe．C版本软件(http：／／qobrue．use．es／jsgroup／MestRe—C，共享软件)进行手动相位调整和基线校正，血清的HNMR谱图以肌酸(6=3．04)作内标，除去因交叉弛豫引起峰型变宽的残余水峰(=4．6～5．1)，对余下的谱图进行积分(=0．2～10)，积分区间均采用=0．01，为了消除样本之间浓度的差异，对每个样本的积分变量进行面积归一化处理，然后对每个新变量进行中心化处理，采用主成分分析(PCA)进行多元统计分析，对所得统计结果再进行方差分析(Analysisofvarian

8、ce，ANOVA)与多重比较检验。3结果与讨论3．1血清的HNMR谱图及多元统计分析血清的组成均一性高，几乎