乙酸胁迫酵母细胞凋亡过程中单个线粒体损伤的拉曼光谱分析.pdf

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1、第43卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第5期2015年5月ChineseJournalofAnalyticalChemistry643～650DOI：10．11895／j．issn．0253-3820．141040乙酸胁迫酵母细胞凋亡过程中单个线粒体损伤的拉曼光谱分析李冰卢明倩王巧贞石贵玉廖威黄庶识(广西师范大学生命科学学院，桂林541004)(广西科学院生物物理实验室，南宁530007)(广西职业技术学院，南宁530226)摘要应用激光光镊拉曼光谱技术(LTRS)作为一种非入侵分析线粒体的工具，结合氧电极法、紫外分光光度计法，研

2、究乙酸胁迫酵母细胞后提取的线粒体，以及直接胁迫正常酵母细胞的离体线粒体的拉曼光谱。结果显示，乙酸胁迫酵母细胞后提取的线粒体的拉曼光谱，归属于核酸的谱峰(1081和1301cm)、蛋白质的谱峰(872，1445，1604和1657em)、脂类的谱峰(1125，1301，1445和1657cm。)、CytC的特征峰(750和1125cm)、线粒体呼吸特征峰(1604cm)，都随着诱导程度的加深而降低，与常规法测定的指标呼吸率，磷氧比，细胞色素C含量的降低，MDA含量的升高的变化趋势相似；乙酸直接胁迫线粒体的拉曼光谱，归属于核酸的谱峰(1081和1

3、30Icm)，蛋白质的谱峰(872，1445，1604和1657em)，脂类的谱峰(I125，1301，1445和1657cm)，Cytc的特征峰(750和1125cm)，线粒体呼吸特征峰(1604em)，都随着诱导程度的加深而降低，与常规法测定的指标呼吸率、磷氧比、细胞色素C含量的降低，MDA含量的升高的变化趋势相似。结果表明，乙酸胁迫细胞过程中，乙酸进到细胞内可能直接作用于线粒体，引起线粒体内物质的释放，导致依赖于线粒体途径的细胞凋亡。关键词拉曼光谱；乙酸胁迫；酵母细胞；线粒体；凋亡1引言乙酸是酵母发酵过程中的一种代谢产物，它不能被酵母代

4、谢，会对酵母细胞产生生理毒害作用，抑制酵母发酵，如果乙酸等代谢产物进一步积累就会诱发酵母细胞大量死亡】．2]。用20200mmol／L乙酸对对数期的酿酒酵母细胞进行胁迫，酵母细胞会发生染色质伴随着核膜的凝聚、细胞膜磷脂酰丝氨酸的外翻和TUNEL显阳性表型等的凋亡现象，当乙酸胁迫同一种稳定时期的酿酒酵母时，发现依赖于线粒体途径的酵母细胞凋亡现象_3：进一步研究发现，酵母细胞凋亡与ROS的产生、CytC从线粒体释放到细胞质中有关l4J。用一定浓度乙酸处理酵母细胞时，发现酵母细胞凋亡过程释放的Cytc能激活Caspase，使Caspase裂解成为有

5、酶解活性的异源二聚体，并引发下游的一系列级联反应，通过裂解特异底物和激活内源性核酸酶最终导致细胞凋亡_5，。但直到目前为止。酵母的代谢产物如何诱导细胞死亡的过程仍不完全清楚。初步的研究表明，其代谢物可通过诱导线粒体中内含物的释放来启动细胞不可逆的凋亡程序。激光光镊拉曼系统(LTRS)是利用激光束形成的光镊固定溶液中的单个活细胞，再经过瞬时增加激光功率同时激发和收集细胞的拉曼光谱，具有无损伤、灵敏、快速等优势，是研究溶液中单个活细胞的有力工具[8l9]。线粒体是真核生物细胞中进行能量代谢的重要细胞器，在功能上线粒体不仅是细胞能量代谢的中枢，还是

6、细胞凋亡的重要参与者；线粒体大小约为0．51m，在缓冲液中可被激光镊子所捕获，避免了由于布朗运动对线粒体的影响。因此，LTRS的应用使得离体有活性的单个线粒体的研究成为可能_1。本研究应用LTRS，研究了乙酸胁迫酵母细胞以及离体线粒体过程中的光谱变化，获得乙酸诱导酵母细胞发生凋亡的过程中．线粒体内核酸、蛋白质、脂类等大分子物质变化的实时信息，是单个线粒体水平上的一种简单快速分析方法。2014—11-27收稿：2015~3—11接受本文系国家自然科学基金资助项目(No．31160018)E—mail：hshushi@gxas．cn分析化学第43

7、卷2实验部分2．1菌株与培养基菌种：安琪酿酒高活性干酵母(安琪酵母股份有限公司)。培养基为YPD培养基：1％酵母提取物、2％葡萄糖、2％蛋白胨。2．2乙酸胁迫酵母细胞以及线粒体的提取2．2．1酵母菌的活化取干酵母粉于YPD液体培养液中，29℃、100r／min培养过夜，将长菌的液体培养基稀释10倍后涂板，29℃培养。挑取单菌落至新鲜的YPD液体培养基中，在29℃以100r／min培养过夜，按1％的接种量接种到新鲜的YPD液体培养基中，再在29cC以150r／min培养，当OD0．8时，即可离心收集菌体。2．2．2线粒体的提取将离心收集的菌体，

8、用菌体预处理缓冲液处理后加入蜗牛酶缓冲液，再加入原生质体裂解液和玻璃珠(425～600m)冰上涡旋破壁，破壁后差速离心法提取线粒体[1lI挖]，线粒体提取液悬浮，4