活体小鼠中单个红细胞的拉曼光谱分析.pdf

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1、第39卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第9期2011年9月ChineseJournalofAnalyticalChemistryl394～1399活体小鼠中单个红细胞的拉曼光谱分析孟令晶林漫漫1,2牛丽媛1,2刘军贤王何健姚辉璐(广科学院生物物理实验室，南宁530003)(广西帅范大学物理科学与技术学院，桂林541004)(广科学院生物T程中心，南宁530003)摘要应用拉曼光谱与光镊技术对活体小鼠毛细动脉和静脉血管中的全m以及毛细lfI=L管中的细胞体外的令j】Ⅱ及单个红细胞进行研究；光谱分析示，可以获得

2、活体m液的托曼光谱；红动脉毛细管和静脉毛细管·f可以观察到清晰的携氧与去氧血液的不同光谱；体内血管巾血红细胞的m红生浓度比1奉外的更高，，}：动脉毛细管中的血红细胞的携氧态特征峰明旺，且具有统汁学差异；动脉毛细管中的pH倩比静脉毛细【0I管中的pH值更高。通过对1604cm特征峰在活体毛细血管中携氧态和走氧态红细胞光谱差异的研究发现，1604cm特征峰的变化与红细胞所处的环境的pH值有关，环境pH值变大，1604cm特征峰的强度减小；环境的pH值变小时，1604cm特征峰的强度变大。以上结果表明．在活体巾研究血液及．个

3、红细胞的信息变化足可以实现的，时表明拉曼光谱与光镊技术是一种进行活体中单个细胞研究的强有力的r具。关键词托曼光谱；单个红细胞；活体l引言红细胞是血液的重要组成部分，其主要功能是将氧从肺部携带到全身组织，并将二氧化碳从组织携带到肺部，排体外。红细胞的运氧功能是依靠血红蛋白(Hb)分子实现的。目前，对红细胞rII血红蛋门的研究较多[1-31。由于拉曼光谱具有高敏感、反应快和无损等优点，已经大量应用在单细胞和组织分子组分的研究中～。激光光镊拉曼光谱技术是将拉曼光谱与光镊技术结合，用于对溶液中的细胞进行无损监测的一种技术～。将

4、此技术应用于红细胞功能的研究较多[2,9,10]。Wood等进行了红细胞携氧态和去氧态光谱差异研究，为_r解红细胞的最基本的运氧功能及诊断有关红细胞疾病提供了依据。但这些研究郁是在体外模拟活体环境进行的，无法模拟体内真正的生理条件。Ivo等对活体小鼠肠膜上血管中的m液进行了共焦拉曼分析，在不破坏血管壁的条件下，获得了血液携氧和去氧光谱信息，应用共焦拉曼光潜技术对生理条件下单个微血管中血液携氧能力进行评估。但此研究只是对流动血液进行比较分析，不能获得单个红细胞信息，并存在光谱积分时间较长的缺陷。存实验巾，虽然未对血管造成

5、破坏，但足¨7于实验需取m小鼠肠膜，实验操作复杂，准备时间较长。本研究采用激光光镊拉曼光谱技术获得活体小鼠耳朵血液系统中正流动血液的拉曼光谱，及动脉毛细血管和静脉毛细血管中被光镊禁的单个红细胞的拉曼光谱。研究表明了激光光镊拉曼光技术埘活体中红细胞研究的优势及其在活体研究巾的可行性。2实验部分2．1实验装置本实验所用的激光光镊拉曼光谱仪的装置罔如图1C所示。图1a为从微镜观察钊的血红细胞血管巾流动的冈像。实验小鼠麻醉后固定在载物台上，将小鼠耳朵紧贴在载玻片上，如罔lb所示。导体激光器(DL740201SSanyoLase

6、rDiode)产生一束波长为780nm的激光，滤波后导入倒置物微镜(TE2000一U，Nikon)的物镜(100×，NA=1-3)，聚焦到被选定的毛细血管内。从被捕获的细胞散射的托20101216收稿；2011—03I4接受本文系罔家f1然科学基金(No．60868002)，广阿自然科学旌金(No2011GXNSFA08143)。棒科院基金(No11YJ24WL02)干l科技攻火目(No071800730)资助Email：yaohl@163net第9期孟令晶等：活体小鼠中单个红细胞的拉曼光谱分析曼光聚焦到光谱仪的入射狭

7、缝。光谱仪(SpectraPro2300i，Acton)的衍射光栅参量是闪耀波长650nm，600／mm。光谱仪耦合到电荷耦合器件CCD(PIXIS100BR，PrincetonInstruments)上，用液氮将CCD冷却到一120。C。为了分辨血管的位置，本实验使用LED灯(560nm)照射小鼠耳朵，并通过CCD摄像机拍照。光谱分辨率为6cm。适合本实验的小鼠耳朵中血管深度在距离耳朵下表皮面20~50gm的位置，血管直径在8～15p,m为最佳。红细胞的直径约为7～8gm。EP图1激光光镊拉曼光谱实验装置示意图Fig

8、．1(a)Typicalimageofredbloodcells(RBCs)circulatinginthevasculature(b)circularpumplaserbeaminthemicrovesseloilmouseearand(c)schematicofexperimentalarrangementTC．温度控制器(T