甜菜M14品系pBIPbmBvM14-MADSbox载体的构建及BvM14-CMO、BvM14-BADH盐胁迫应答分析.pdf

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1、中文摘要甜菜M14品系是由野生白花甜菜(BetacorollifloraZoss．)和二倍体栽培甜菜(BetavulgariL．)通过种间杂交及回交得到的附加白花甜菜9号染色体的单体附加系。M14品系具有兼性无融合生殖的特性，是寻找优质基因难得的试验材料。实验室前期通过差异显示技术和抑制消减杂交技术从甜菜M14品系中获得了特异表达基因BvMl4一MADSbox的eDNA全长。王玉婷已通过染色体步移获得BvMl4-MAD‘妨OX基因的上游序列，通过PCR获得基因启动子的序列，初步定名为Pbm，并通过启动GUS报告基因的表达初步

2、验证了Pbm的启动效率。本试验利用已获得的BvMl4-MADSbox基因特异启动子序列设计带有HindIII、XbaI酶切位点的PCR引物，构建BvMl4-MADSbox基因特异启动子Pbm的pBUPbm／BvM14．MADSbox表达载体。甜菜M14品系BvMl4．CMO基因是盐诱导表达基因，通过同源序列克隆法，克隆出BvMl4．CMO的cDNA片段。生物信息学分析该基因全长1341bp，编码446个氨基酸。后续工作以该基因作为研究甜菜M14品系参与胁迫反应的应答基因之——o甜菜M14品系经本实验室前期研究具有较强的耐盐性

3、，可以在500mmol／LNaCl胁迫处理下生长良好。本研究以甜菜M14品系的苗期为研究材料，对其进行了0、200、400mmol／L不同NaCl浓度胁迫处理24h后，对合成甜菜M14品系甜菜碱的BvMl4．CMO、BvMl4．BADH基因进行了实时定量PCR研究发现：甜菜M14品系叶片中两基因在不同浓度NaCl胁迫处理下相对表达量一致，随着浓度的增加，且呈现先下降后上升的趋势，在200mmol／LNaCl胁迫处理下两者相对表达量最低；甜菜M14品系根中BvMl4．CMO、BvMl4一BADH的相对表达量一致，随着浓度的增加

4、，呈现先上升后下降的趋势，并且在200mmol／LNaCl胁迫处理下达到最高。同时采用比色法测定了不同浓度NaCI胁迫后甜菜M14品系叶片与根中甜菜碱含量的变化。发现随着盐浓度的增加，甜菜碱含量整体呈现上升趋势，对于甜菜M14品系叶片来说，甜菜碱含量在200mmoFLNaCI胁迫处理下达到最低，与合成甜菜黑龙江大学硕士学位论文lIIIIIIIIIIIIIllllIIIIIIIY2322579碱的两基因相一致：但在根中，甜菜碱含量在400mmol／LNaCl胁迫处理下达到最向。关键词：BvMl4．MADSbox基因；组织特异性

5、启动子；BvMl4。CMO基因；BvMl4-BADH基因；实时定量PCRAbstractMonosomicadditionlineM14ISaninterspecifichybridcrossedbetweenawildspecies丑corollifloraZoss．andacultivatedB．vulgarisL，whichcontainedthealienchromosome9mof丑corollifloraZoss．ThesugarbeetM141inehasthecharacteristicsofapomixes

6、SOitisavaluablegeneticresourceforisolatingexcellentgenes．Previously,thecDNAfulllengthsofBvMl4一MADSboxgenehasbeenalreadyobtainedintheuseofDDRT-PCRandSSHtechnology．IntheresearchofWangYuting，theupstreamsequenceofBvMl4-MADSboxgenewasobtainedusingChromosomeWalking．These

7、quenceofpromoterwhichnamedPbmwasobtainedbyPCRandthestartefficiencyofitwaspreliminaryidentificationbystartingofGUSgene．TheexpressionvectorpBI／Pbm／BvMl4-MADSboxofspecificpromoterofBvMl4-MADSboxgenewasconstructedbydesigningprimerwithrestrictionsitesofHindⅢ、XbaIusingse

8、quenceofspecificpromoter．TheBvMl4-CMOgeneissalt-inducedgene．TheeDNAfragmentofBvMl4一CMOwasclonedbyhomology—basedcloningwhichusedtostudymonosomicad