甜菜M14品系BvM14-glyoxalaseⅠ基因的克隆与功能分析.pdf

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1、中文摘要甜菜M14品系是在栽培甜菜(BetavulgarisL．)染色体组上附加野生白花甜菜(B．corollifloraZoss．)第9号染色体的甜菜单体附加系。经鉴定甜菜M14品系具有野生白花甜菜的一些优良性状，如抗旱性、耐盐性、抗寒性以及无融合生殖等，课题组推测甜菜M14品系展现的优良性状可能与白花甜菜第9号染色体的导入有关，因此甜菜M14品系是挖掘和利用甜菜优质基因，促进栽培甜菜育种改良的良好材料。前期工作基础中，课题组以栽培甜菜为对照，对甜菜M14品系花器官进行了比较蛋白质组学研究，共获得差异蛋白质点7

2、1个，乙二醛酶I是其中之一。甜菜M14品系盐胁迫下的比较蛋白质组学研究发现，乙二醛酶I蛋白在叶片中受盐胁迫上调表达(2倍)，说明乙二醛酶I可能参与甜菜M14品系的抗盐过程。本试验是对甜菜M14品系乙二醛酶I基因功能的深入研究。乙二醛酶I与能量代谢密切相关，广泛存在于动物、植物和微生物中。在辅因子还原型谷胱甘肽(GSH)的协助下，乙二醛酶I将丙酮醛(methylglyoxal，MG)转化为S．D哥L酰谷胱甘肽，乙二醛酶II以其为底物，最终转化为D．乳糖，从而降低MG含量，解除MG对细胞的毒害损伤。除此之外，乙二醛酶

3、I还参与调控细胞的分裂和增殖、微管组装、囊泡的活化等过程，与细胞的有丝分裂过程密切相关。近年来，研究发现乙二醛酶I广泛参与植物非生物胁迫的应答反应，同时还对病菌侵染植物组织产生应答现象，说明植物乙二醛酶I在作物改良及植物抗逆机制研究中具有潜在的应用价值。本试验基于课题组的前期工作基础，利用电子克隆及RACE技术获得甜菜M14品系乙二醛酶I基因(BvMl4-glyoxalase，)cDNA全长，共计1449bp，包含1065bp的最大ORF，编码354aa；序列分析显示，该蛋白质含有两个乙二醛酶结构域及多个谷胱甘肽

4、、金属离子结合位点；半定量RT-PCR分析结果显示lYIIIIIIl2IIIIIIllIIIlll2IIIIll2tlllll4IIIL15IIIIItl2lIII黑龙江大学硕士学位论文BvMl4-glyoxalase，基因在甜菜M14品系根、茎、叶、花中广泛表达，且在花中表达量最高；该基因能够应答高盐、干旱、氧化胁迫，并在根和叶中参与不同的应答机制。构建了BvMl4-glyoxalase，基因的大肠杆菌表达体系，在0．5mmol／LIPTG、37。C的诱导条件下BvMl4．glyoxalaseI蛋白表达量最大，

5、并主要以包涵体的形式存在；Western印迹结果呈阳性，说明BvMl4．glyoxalaseI融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中能够正确表达。以转空质粒菌株为对照，对转BvMl4-glyoxalaseJ基因的大肠杆菌BL21(DE3)菌体在MG胁迫下的生长曲线进行了测定，结果显示转基因菌株比对照菌株提前1h进入生长期，说明BvMl4-glyoxalaseI基因能够缓解MG对大肠杆菌生长的抑制。构建BvMl4-glyoxalaseI基因植物表达载体，并在烟草中稳定表达。通过基因组PCR及RT-PCR筛选阳性植株

6、；酶活测定结果显示，To代转基因植株G2和G3叶片中glyoxalaseI酶活力分别是对照野生型烟草WT的2．2倍和1．5倍，说明BvMl49lyoxalaseI基因在转基因烟草中成功表达。叶盘抗性试验结果显示，在不同浓度的MG、NaCI、甘露醇及H202胁迫下转基因烟草G2叶片的褪绿速度远远低于WT叶盘。以WT幼苗为对照，对T1代转基因烟草幼苗line2进行上述胁迫处理，结果显示line2幼苗生长状况、鲜重、根长、叶片褪绿情况均好于WT幼苗。以上结果证实甜菜M14品系BvMl4-glyoxalase』基因的过量

7、表达能够提高烟草对MG、高盐、干旱及氧化胁迫的抗性。本试验通过对甜菜M14品系BvMl4-glyoxalaseI基因的深入研究，为研究glyoxalaseI基因的抗性机制提供了重要资料。关键词：甜菜M14品系；乙二醛酶I；原核表达；抗逆AbstractMonosomicadditionlineM14isaninterspecifichybridcrossedbetweenawildspeciesBcorollifloraZoss．andacultivatedspeciesB．vulgarisL．，whichcon

8、tainedthealienchromosome9也ofB．corollifloraZoss．addedtotheB．vulgarisL．genome．SomereportsshowedthatM14linehadexhibitedthecharacteristicsofapomixisandstresstolerance(suchasdrought，highsaltan