p85与S-2结合调控ERKMAPK通路的活化.pdf

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1、张苗：p85与Spred-2结合调控ERK／MAPK通路的活化一三p85与Spred-2结合调控ERK／MAPK通路的活化研究生：张苗导师：孟松树副教授中文摘要Spred(Sprout—relatedEna／vasodilatorstimulatedphosphoproteinhomology-l(EVH-1)domain)蛋白家族与Sprouty相关，包括3个主要结构域：N端结构域(EVH．1区)，中央c．kit结合区(KBD区)和C端的半胱氨酸富含区(SPR区)。EVHl区是特异结合富含脯氨酸的序列，将蛋白锚定到特定位点行使功能，例如：骨架重构；肌动蛋白调节；突触转导；增殖和分化等

2、。KBD区是包含一段致癌受体酪氨酸激酶e-kit的结合序列，对生长因子(EGF、EPO)介导的ERK／K的活性有抑制作用，但非必需。SPR区是非常保守的富含半胱氨酸sprouty相关序列，负向调节生长因子介导的Erk的活性。同时Spred对多种生长因子诱导的Ras．ERK途径有抑制作用。Spred蛋白家族负向调节Ras／ERK通路并影响细胞增殖和细胞分化，SPR区在该过程中起重要作用，然而其作用机制尚未阐明。本研究发现，磷脂酰肌醇3-激酶(P13K)的p85亚基与Spred．2蛋白的SPR区相结合。此外，SPR区的第303位、343位、353位酪氨酸共同突变不仅能够剥夺表皮生长因子介导

3、的Spred-2蛋白与p85亚基的结合，还会减弱Spred·2蛋白对Ras／ERK活化作用的抑制。因此与野生型相比，Spred．2蛋白突变体导致Hela细胞增殖加快、PCI2细胞分化加强。进一步的研究表明，p85亚基与Spred-2蛋白的结合能够增强Ras蛋白与Spred-2蛋白结合，同时还能降低Spred-2蛋白本身的泛素化，从而进一步加强Spred-2蛋白的抑制作用，影响Ras／ERK活化。取得的研究结果如下：1、293T细胞经脂质体转染pRK5．Myc．Spred一2质粒及其各段缺失体，经饥饿、刺激等处理后通过免疫共沉淀实验和Westernblot检测发现p85亚基与Spred．

4、2蛋白结合并且依赖于Spred．2蛋白的SPR区和p85亚基的SH2区。2、采用分子亚克隆技术及PCR法定点诱变分别构建了Spred．2蛋白SPR区第303位、343位、353位酪氨酸的单突变体，343位、353位酪氨酸的双突变体以及同时突变三个位点的三突变体，进行免疫共沉淀实验和Westernblot检测到SPR区的第303位、343位、353位酪氨酸共同突变不仅能够剥夺表皮生长因子介导的Spred．2蛋白与p85亚基的结合，还会减弱Spred．2蛋白对Ras／ERK活化的抑制。2扬州大学硕士学位论文3、将空载体、p85亚基及其缺失体分别与Sprexl．2蛋白和Ras蛋白共转染，发现

5、p85亚基与Spred．2蛋白的结合能够增强Ras蛋白与Spred．2蛋白相互作用，同时还能降低Spred-2蛋白本身的泛素化，从而进一步加强Spred．2蛋白的抑制作用。4、通过构建空载体、Spred．2蛋白及其突变体、缺失体的重组腺病毒分别感染Hda和PCI2细胞、采用台盼蓝计数法和神经突触伸长分析发现与野生型相比，Spred．2蛋白p85亚基结合位点的突变体导致Hda细胞增殖加快、PCI2细胞分化加强。综上所述，本研究发现经EGF*U激后，p85亚基被招募至Spred．2蛋白，且Spred．2蛋白的Tyr303、343及353位点对于EGF诱导的p85亚基与Spred-2蛋白的结

6、合及Spred-2蛋白对Erkl／2活化的抑制均是必需的。p85亚基与Spred．2蛋白能够增强Ras蛋白与Sprcxi．2蛋白结合，同时还能降fESpred一2蛋白本身的泛素化，从而进一步加强Sprtxi．2蛋白的抑制作用，这是有关Sprexi．2蛋白与p85亚基相互作用参与调节EGF介导的Erkl／2活化的首次研究。关键词：Spred．2蛋白；p85亚基；丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)—p—85int—eract—swit—hSpr—ed2to．㈣嬲modu筒铃1二彤，activationofERK／MAPKpathway4扬州大学硕士学位论文3．p85bindingtoSpred

7、2enhancedSpred一2-mediatedinhibitoryeffectviaincreasedRasbindingtoSpred一2anddecreasedSpred一2ubiquitinationandEGF-inducedactivationofERKl／2wasfurtherattenuatedincellsCO··transfectingp85withSpred·-2comparedtocellstransfectingwi