基础生化实验-蛋白质纯化.doc

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1、蛋白质纯化一、目的:利用金属亲和性管柱(metalaffinitycolumn)来大量纯化带有affinitytag的基因重组蛋片。二、原理：由于六个Histidine所组成的HisTag(metalaffinitytag)可与Ni2+bind,所以利用基因重组技术在表现的蛋白质加上HisTag,再以金属亲和性管柱(Ni-NTA)(此His-tag序列可与带二价正电的阳离子相螯和)及liquidchromatography来大量纯化蛋白质。三、试剂与器材：Uoading(binding)buffer(10mMimidazole,0.3MNaCI,50MmTris-HCIPh7)◊细

2、菌回溶成为蛋白质的载体以保持活性2.washbuffer(20mMimidazole,0.3MNaCI,50MmTris-HCI,Ph7)3.elutionbuffer(20mMEDTA,0.3MNaCI,50MmTris-HCI,Ph7)上课补充：◊蛋白质很脆弱，需要在特殊的buffe「里。四、仪器与设备:FPLC（速液相色谱仪）五、步骤：1・将管柱架在铁架上，把亲和性胶体悬浮装填于管柱内。2.以2~3倍CVloadingbuffer清洗管柱后，注入蛋白质样本。3.以washbuffe「梳洗，2到3倍column体积。4•用washbuffer和elutionbuffer进行线性

3、梳洗，并收集流出液体，以FPLCUVmonitor上的OD280数据读取样品流出与否，并观察冲离液之曲线图。上课补充：◊胞内型分泌需要用超音波破菌，因为会放热所以要放在冰屮使用。◊线性梳洗为加入elutionbuffer•会有颜色变化会把鎳离了跟imidazole冲洗掉，剩下胶体溶液。◊其屮imidazole和Histidine类似也会和鎳离了结合所以会竞争，可拿来洗涤蛋白质。（可详见问题一及补充资料2）六、问题:问题-：Imidazole的结构与特性。Imidazole又名咪哇即1,3•二氮哇，是一个五元杂环芳香性有机化合物，化学式C3H4N2o它也是一个牛物碱。白色或浅黃色固体

4、结晶，可溶于水、氯仿、醇、醸，具有酸性，也具有碱性。氢原子在两个氮原子之间移动，因此存在两个互变界构体。咪卩坐环结构在牛物分子屮广泛存在，例如组氨酸和对应的荷尔蒙组胺。很多药物也包含有咪卩坐环，例如硝基咪卩坐和咪卩坐类抗真菌药物。咪瞠Hj・・43HHH21英文名ImidazoleIUPAC英文名1,3-diazoleIUPAC屮文名1,3■二呼别名间二氮茂、咁恶嚇识别CAS号288-32-4RTECS号N133251985-86性质化学式C3H4N2摩尔质量68.08gmol1外观白色或浅黄色固体密度1.23g/cm3熔点89-91°C(362-364K)沸点256°C(529K)

5、在水屮的溶解度易溶14.5pAb6.95结构晶体结构单斜分子构型平面五元环结构与性质咪卩坐为平面五元环状化合物，易溶于水(以无限比例)和其它极性溶剂。咪卩坐的两个氮原子间存在永久偶极，极性很强，偶极矩为3.61D,并且分子间存在氢键缔合，导致了咪卩坐具有反常高的沸点(256°C)。分子屮存在•一个6电子共轨大兀键，故具有典型的芳香性。与氢以。键相连的氮原子提供一对电子，环内其余四个原子各提供一个电子成键。1N上有氢的咪哇环屮，氢原子可以在两个氮原子间迁移，存在两个互变界构体，04和C・5是等同的。这两个互变异构体无法分离，当有取代基吋，常以「4⑸■取代咪呼」（如4（5卜甲基咪卩坐）

6、来命名。组氨酸牛成组胺的反应如下所示：咪卩坐一个用途是在金属螯合亲和层析（IMAC）屮用于His标签蛋白的纯化。标签蛋白与展桩柱表面珠孔内的規离了介质发牛结合，过量的咪卩坐通过层析柱，将与鎳配位的标签蛋白洗脱下来，得到高纯度的冃标蛋白。咪卩坐是许多药品的重要组成部分。许多杀菌剂和抗真菌、抗原虫和抗高血压的药物屮含有合成咪卩坐。咪卩坐是茶叶和咖啡豆屮含有的茶碱分了的组成部分，具有刺激屮枢神经系统的作用。通过干扰DNA的活动抑制白血病的抗癌药物毓嚓吟小也含有咪卩坐。问题二:2.ETDA的资料（整理）EDTA乂名乙二胺四乙酸(EthyleneDiamineTetraaceticAcid)

7、简称：EDTA简称：EDTA俗名；依地酸（特别是它的钙盐络合物,医学上称为依地酸钠钙）俗名;依地酸（特别是它的钙盐络合物,医学上称为依地酸钠钙）分子量：292.248分子量：292.248分子式：C10H16N2O8分子式：C10H16N2O8为理化性质白色无臭无味、无色结晶性粉末，熔点240°C（分解）。白色无臭无味、无色结晶性粉末，熔点240°C（分解）。不溶于冷水、醇及一般有机溶剂，微溶于热水，溶于氢氧化钠,碳酸钠及氨的溶液屮，能溶于160份100°C沸水。不溶