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1、蛋白质纯化实验室实验手册祁超2007年10月第一章外源基因在大肠杆菌中的表达一、通过聚合酶链式反应（PCR）将靶基因亚克隆到质粒载体上（一）PCR引物设计的基本原则与PCR反应组分和条件1.PCR引物设计的基本原则（1）引物与靶基因间配对的碱基一般为15-20。（2）引物碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤、嘧啶堆积现象，引物G+C含量宜在45-55%左右。（3）引物内部不应形成二级结构，两个引物之间尤其在3’末端不应有互补链存在。（4）引物的碱基顺序不应与非扩增区域有同源性。可用计算机进行辅助检索分析。（5）引物3’末端一般以单个C或G结尾。2.PCR反应组分和条件
2、PCR反应体系一般选用50μl体积，其中含有：10×Reactionbuffer，5μl2个引物，各12.5-25pmol(终浓度各0.25-0.50μmol/L)4种底物（dATP+dCTP+dGTP+dTTP），各200μmol/L模板DNA，100ng左右TaqDNA聚合酶，2.5-3UPCR反应条件一般为：（1）94℃，5分钟（2）94℃变性30-60秒（3）50-55℃退火30-60秒（4）70-72℃延伸30-60秒（5）72℃5-10分钟共进行25-35次循环。循环是步骤（2）和（4）(二)质粒DNA的小量制备1、传统方法（1）用灭菌牙签挑单菌落于3
3、mlLB培养液中，37℃培养过夜。（2）在每个EP管中倒入1ml左右的过夜培养物，6,000rpm离心1分钟以收集菌体。（3）将菌体重悬于100μl4℃预冷的溶液I中，并加入200μl新配制的溶液II,盖紧管口，快速颠倒离心管6-7次，然后，冰浴5分钟。（4）加150μl4℃预冷的溶液III,倒置5-6次以混合内容物，然后，冰浴5分钟。（5）12,000rpm离心10分钟后，小心吸取上清至另一EP管中。（6）加2倍体积的无水乙醇，振荡混合，并在室温放置5分钟。（7）12,000rpm离心5分钟后，移去上清，并用70%乙醇漂洗DNA沉淀。DNA沉淀自然干燥，并溶于2
4、0μl双蒸水或1×TE缓冲液(10mmol/LTris,1mmol/LEDTA,pH8.0)中。2.Promega公司WizardPlus小量DNA纯化方法-离心方案（适用于产品A1330，A1340，A1460及A1470）（1）12,000rpm离心1分钟，以沉淀1-10ml过夜培养物。（2）用250μlCellResuspensionSolution充分悬浮大肠杆菌细胞。（3）加250μlCellLysisSolution，倒置5-6次混合。（4）加10μlAlkalineProteaseSolution，倒置5-6次混合，室温放置5分钟。（5）加350μl
5、NeutralizationSolution，倒置5-6次混合。（6）室温，最高转速离心10分钟，回收上清。（7）将离心柱插入收集管中。（8）将上清倒入离心柱中。（9）室温，最高转速离心1分钟，倒掉流穿液，将离心柱重新插入收集管中。（10）加750μlWashSolution（加乙醇），最高转速离心1分钟，倒掉流穿液，将离心柱重新插入收集管中。（11）重复步骤（10）（用250μlWashSolution）。（12）室温，最高转速离心2分钟。（13）将离心柱插入一个无菌的1.5ml微量离心管中。（14）在离心柱中加50-100μlNuclease-FreeWate
6、r，室温，最高转速离心1分钟。（15）DNA溶液保存在-20℃备用。(三)质粒DNA的中量制备1.在100ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养液中加入1mlpET-15b/Novablue甘油菌，37℃培养过夜；2.4℃,4,000rpm离心10分钟以收集菌体；在菌体用3ml溶液I(50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris,pH8.0,10mmol/LEDTA,pH8.0)充分悬浮后，加入6ml溶液II(0.2mol/LNaOH,1%SDS)，并倒置混合，冰浴5-10分钟；3.加入4.5ml溶液III（60ml5mol/L乙酸钾，11.5ml冰乙酸和
7、28.5ml水），轻摇混合，冰浴10分钟；4.4℃，12,000rpm离心20分钟，小心吸取上清至另一个50ml离心管中；加入0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温放置10分钟；5.室温，10,000rpm离心10分钟以沉淀DNA；6.在沉淀用70%乙醇漂洗，自然干燥，并溶于0.3ml的TE(10mmol/LTris,1mmol/LEDTA,pH8.0)缓冲液中，然后转入EP管中；7.加入等体积的5mol/LLiCl,室温，10,000rpm离心10分钟以沉淀大分子RNA分子；8.回收上清，加入等体积的异丙醇，室温放置10分钟，12,000rpm离心5分钟以沉淀DNA；
8、9.DNA
