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1、蛋白质分离纯化及鉴定综合实验一、实验内容将昆虫总蛋口通过匀浆的方法溶解于磷酸氢二纳/磷酸二氢纳缓冲液中，离心取上清液作为蛋白质粗提液用考马斯亮蓝G-250法测定蛋片质浓度；将粗提液通过SephadexG25凝胶层析柱进行分离，分部收集流出物，得到不同的组分，测定不同组分的蛋白质浓度；将蛋口粗提液和收集到的各组分进行SDS-PAGE分析，比较粗提液和各组分屮蛋白质的成分，分析分离效果。二、实验过程：1.蛋白质粗提液制备溶液配制：0」mol/LpH7.4磷酸缓冲液(1)1000ml0.1mol/L磷酸氢二纳；磷酸氢二纳溶于800mL蒸憾水中，定容至1L；(2)250mL2.
2、蛋白质浓度测定(1)溶液配制1mg/mL牛血清口蛋口(BSA)标准溶液：5mg牛血清白蛋白溶于5ml水中；考马斯亮蓝G-250蛋白试剂：称取100mg考马斯亮蓝G250溶于50ml90%的乙醇溶液中，加入85%的磷酸100mL,最后用蒸饰水定容到1000mL,滤纸过滤,避光保存。(2)0-100ug/mL标准曲线测定：取6支试管，按下表配制蛋口质浓度梯度各2mL蛋白质浓度0204060801001mg/mLBSA溶04080120160200液(Pl)蒸镭水(山)200019601920188018401800总体积(山)200020002000200020002000
3、测定各个浓度的标准溶液595nm吸光值(OD595)：500uL蛋口质溶液与2.5mL考马斯亮蓝G250溶液混匀，用分光光度计测定OD595,每个溶液3次重复测定。以OD595值(3次重复的平均值)为X,蛋白浓度为Y做直线，得出标准曲线Y=aX+b,R=?o(3)测定粗提液蛋白浓度，将粗提液用蒸傭水稀释100倍(2mL),取稀释液500uL与2.5mL考马斯亮蓝G250溶液混匀，用分光光度计测定OD595,以500uL蒸饰水+2.5mL考马斯亮蓝G250溶液混匀作为空白对照，3次重复测定，用平均值计算其浓度。3、SephadexG-25凝胶层析柱进行分离(1)凝胶溶胀：
4、将固体凝胶在一定量的沸水浴中溶胀5h,溶胀后倾去上清液，加入一定量的蒸憾水搅拌，静置使凝胶下沉，倾去上清液，直至无细小颗粒为止。(2)装柱：蒸憾水冲洗柱子，留少量蒸憾水，打开活塞，将悬浮于水屮的凝胶连续灌入柱中，直至凝胶沉淀至柱的4/5体积处。（3）平衡：用10倍于柱床体积的0.1mol/LpH7.4的磷酸缓冲液洗柱，是柱中的离子环境和样品屮的一致。（4）上样：柱床表面液体正好达到凝胶表面，关闭活塞，将蛋£1粗提液（留过20uL供电泳用）缓慢加到凝胶表面，注意不能把凝胶冲起来（5）收集：打开活塞，使样品流下，样品完全进入凝胶后，缓慢加入0.1mol/LpH7.4的磷酸缓
5、冲液（注意不能把凝胶冲起来）使样品继续流出，分部收集流出物，第一管收集ImL,以后每管收集200uL,共收集6管。（6）稀释20倍，测定每个组分的蛋口浓度，可只测定一个OD595值，计算各组分的蛋白浓度。4.SDS—PAGE溶液配制：100ml30%凝胶储液（arc/bis）：29.2g丙烯酰胺和0.8g卩叉双丙烯酰胺溶丁•80ml蒸憾水中，定容至100ml,避光保存。（该溶液有神经毒性，避免接触皮肤）；100mL1.5MTris-HCl三（轻甲基）氨基甲烷，pH8.8：18.15gTris碱溶于60mL蒸惚水中，用HC1调pH至8.8,定容至100ml蒸惚水中；100
6、ml0.5MTris-HCl（缓冲液）,pH6.8：6gTris碱溶于60ml蒸馆水中,用HC1调pH值至6.8,定容至100ml蒸谓水屮；10ml±样缓冲液：0.5mlddH2O（重蒸水，经过两次蒸饰的水）+2.5mlof0.5MTris-HCl,pH6.8+2mlth由+4ml10%SDS（十二烷基硫酸钠）+77」mgDTT（二硫苏糖醇）+lml0.05（W/V）滉酚蓝；600ml5X电泳缓冲液（?）•.9gTris碱+43.2g甘氨酸+3gSDS,蒸憎水溶解定容至600ml；lml10%过硫酸彼溶液（现用现配）：O.lgil硫酸钱溶丁•lml蒸憎水中。1000ml
7、固定液：取908ml50%的甲醇和92ml冰乙酸混匀；500ml染色液：0.25g考马斯亮蓝R（G?）250,加500ml固定液溶解，过滤后避光保存；1000ml脱色液：取75ml冰乙酸和50ml甲醇，加蒸饰水定容至1000ml□凝胶制备7.5%分离胶（20ml）10%SDS0.2mlddH2O11.87ml10%的AP（过硫酸钱溶液）0.1mlTEMED（.四甲基乙二胺）10W30%arc/bis5ml1.5MpH8.8Tris-HCl2.5ml4%浓缩胶（10ml）ddH2O6ml30%arc/bis1.3ml0.5MpH6.8Tri
