蛋白质的提取与分离纯化——生化实验设计讲解课件.ppt

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1、生化实验设计——蛋白质的提取与分离纯化主讲人：第三组组员：已知某蛋白的分子量约为17kDa，等电点3.9~4.1，它能耐一定的高温，在90C加热3~4min后仍然能够保持80%的活性。该蛋白含有较多的疏水性残基，与Ca2+结合后可以暴露它的疏水基团。该蛋白的作用是作为生物体内酶的激活剂。请设计一个从脑组织中提取和分离纯化该蛋白的实验方案，要求写出具体的步骤和理由，以及检测方法。文献查得：钙调蛋白（CaM）是由148个氨基酸组成的单链分子,其pI值在3.9-4.1之间,分子量约为17KDa.该蛋白能够耐一定的高温，在90oC加热3-4min后仍然能够保持80%的活性。该蛋白分子中含有较

2、多的疏水性残基，与Ca2+结合后可以暴露出它的疏水基团。整个实验过程一般可分为5个阶段：①材料的选择和预处理②细胞的破碎（有时需进行细胞器的分离）③提取④纯化（包括等电点沉降法，盐析，有机溶剂沉淀，吸附、层析、等）⑤分析鉴定。一、材料的选定：大鼠脑组织预处理：将切取的组织用4℃预冷的0.01mol/l的PBS漂洗去血渍，再用滤纸吸干残留的PBS（磷酸盐缓冲液）。实验步骤：二、a细胞的破碎⑴机械方法主要通过机械切力的作用使组织细胞破坏。常用器械有：①玻璃匀浆器（用两个磨砂面相互摩擦，将细胞磨碎）②高速组织捣碎机（转速可达10000rpm，具高速转动的锋利的刀片），宜用于动物内脏组织的破碎

3、⑵物理方法主要通过各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法。Ⅰ反复冻融法Ⅱ冷热变替法Ⅲ超声波法⑶化学及生物化学方法玻璃匀浆机b、细胞器的分离细胞器的分离一般采用差速离心法。细胞经过破碎后，在适当介质中进行差速离心。从破碎材料或细胞器提出的蛋白质是不纯的，需进一步纯化。纯化包括将蛋白质与非蛋白质分开，将各种不同的蛋白质分开。选择提取条件时，就要考虑尽量除去非蛋白质。一般总是有其它物质伴随混入提取液中。但有些杂质（如脂肪）以事先除去为宜。先除去便于以后操作。常用有机溶剂提取除去。三、蛋白质粗提取三、蛋白质粗提取原理：利用蛋白质在PH等电点时的溶解度最小，因而会以沉淀的方式析出。试剂：柠檬酸

4、、磷酸氢二钠步骤：1．向试管中加入磷酸氢二钠和柠檬酸，使其PH=4。2．将提取的溶液加入到第1步骤所配的缓冲液中。3．静置一段时间，待沉淀完全。4．过滤或离心出粗产品。注意事项：防止局部过酸或过碱造成蛋白质变性。金属螯合亲和层析固定化金属螯合亲和层析是建立在蛋白质表面的氨基酸与固定化金属离子的亲和力的不同来进行蛋白质分离的一项技术。过渡态金属离子能够与电子供体，如氮、硫、氧等原子以配位键结合，金属离子上剩余的空轨道是电子供体的配位点，当它在溶液中会被水分子或阴离子占据。钙调蛋白的外形似哑铃,有两个球形的末端,中间被一个长而富有弹性的螺旋结构相连,每个末端有两个Ca2+结构域,每个结构域

5、可以结合一个Ca2+,这样,一个钙调蛋白可以结合4个Ca2+,钙调蛋白与Ca2+结合后的构型相当稳定。四、精细纯化值得注意的是，在洗脱时，会有少许配基与蛋白质一同被洗脱下来，因此常在其后加一凝胶层析以除去小分子的配基。凝胶层析法属最常用的蛋白质分离方法。系混合物随流动相流经装有凝胶作为固定相的层析柱时，混合物中各物质因分子大小不同而被分离的技术。在洗柱过程中，分子量最大的物质不能进入凝胶网孔而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外。分子量最小的物质因能进入凝胶网孔而受阻滞，流速缓慢，致使最后流出柱外。五、分析鉴定A、定性分析SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）测定蛋白质分子量：是在聚丙烯酰胺

6、凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠），SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳·时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW

7、=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。B、定量分析紫外检测法、考马斯亮蓝法、Folin-酚试剂法（最常用方法）Folin-酚试剂法包括两步反应：第一步是在碱性条件下，蛋白质与铜作用生成蛋白质-铜络合物；第二步是此络合物将磷钼酸-磷钨酸试剂（Folin试剂）还原，产生深蓝色（磷钼