动物骨髓细胞染色体的制备与观察.doc

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1、实验七动物骨髓细胞染色体的制备与观察［实验目的］1.通过青蛙或小门鼠骨筋细胞染色体的制备，初步掌握低渗法制备动物骨髓细胞染色体的方法。2.熟悉染色体的形态、种类及青蛙、小白鼠等动物染色体的数目或类别。［实验原理］骨惱细胞是具有吒盛分裂能力的细胞，从这些分裂细胞中，可观察到处于分裂中期的染色体，能对一种动物染色体的形态特征、数目进行准确的观察和分析。山于骨髓直接涂片观察到的分裂相少，效果差，I大1此要对骨髓细胞进行必要的处理。这个处理方法称为低渗法，其基本要求首先是要获得较多的中期分裂相。秋水仙索对分裂期纺锤丝的形成具

2、冇破坏作用，当动物被注射适量的秋水仙索后，处于分裂增殖中的骨髓细胞山于纺锤丝不能形成，中期染色体不能正常趋向两极，到达后期、末期，因而大量的细胞处于观察染色体形态最佳的分裂中期。其次是要能够清楚的观察染色体的形态。为了达到此目的，瑕出的骨髓细胞要经过低渗（kcl溶液）使细胞膨胀、染色体适当的分散。固定（甲醇、冰醋酸）使染色体保持完好的形态。染色（giemsa液）使染色体易分辨、规察。制备优良的标本可获得满意的规察效果。利用动物骨髓制作染色体规察标本取材容易，不需培养，不需无菌操作，比较简便，是生物学实验教学中常用的方

3、法。一般选用的动物有青蛙、蟾赊、小白鼠、大白鼠等。［实验用品］1.动物：青蛙或小白鼠、大白鼠、蟾赊，雌雄均可。2.试剂:0.02%秋水仙素、0.075mol/l氯化钾（kcl）、3:1甲醇、冰醋酸固定液、吉姆萨（giemsa）染液、香柏油或液体石蜡、二甲苯。3.器材：解剖盘、小银子、剪刀、注射器（2ml、5ml各一支）、刻度离心管、玻璃吸管、预冷载玻片、染色缸、玻片盒、量筒（10ml、50mk100ml各一支），恒温水浴箱，盘架天平（配备等大的小烧杯两个）、电吹风、显微镜、吸水纸、擦镜纸、酒精灯、火柴。［实验内容打方

4、法］一、试剂配制1.0.02%秋水仙索溶液：秋水仙素2mg,灭活生理盐水(蛙类0.65%、哺乳类0.85%的nacl)10ml溶解，避光保存。2.0.075mol/lkcl溶液:原液：kcl11.8g双蒸水100ml溶解。使用液：原液1份，双蒸饰水19份混合，3.吉姆萨(giemsa)染液：原液：吉姆萨染粉0.5g,甘油33ml,甲醇33ml,配制时先将giemsa粉置于研体中,加入少量甘油，研磨至无颗粒，再加入余下的H油，拌匀后放入56°C温箱中保温2小时，然后取出加入甲醇，充分拌匀,滤纸过滤卅棕色瓶密封,避光保存

5、，一般要放置2周后才能使用。使用液：原液1份，Ph6.8磷酸缓冲液9份稀释。使用液不宜长期保存，--般现配现用。4.ph6.8磷酸缓冲液：该液可先配成甲液和乙液，然后混合使用。甲液:kh2po40.907g蒸馅水100ml溶解。乙液：na2hpo4•2h：＞01.18g(或naihpo4・12hX)2.38g)加蒸水100m1溶解。使用液(ph6.8):甲液50.8ml,乙液49.2ml混合,该使用液也不易久放，一般也是现配现用。二、染色体制备各种动物骨攏细胞染色体的制备方法基木都采用低渗法，现以青蛙为例，说明其制备

6、的过程。1.取健康小鼠一只，按侮10g体巫山腹腔注入含量为0.02%的秋水仙素0.3m1(此步在实验前12〜24小时完成，哺乳动物在实验前2〜4小时完成)。1.将青蛙处死，迅速取出后腿长骨，包括股骨和胫骨，为了获得较多的骨髓细胞，前肢亦可使用。2.用剪刀、锻子剥离肌肉及结缔组织，剪去两头的骨结,迅速用5ml注射器抽取0.075mol/l的kcl溶液，从一头插入骨髄腔冲洗，冲洗液接入刻度离心管内，反复多次，宜至骨髄腔变白。此时不要让组织块掉进离心管，如掉入，一定要用蹑了或吸管取出。加低渗液至5ml或丽1刻度,放入37°

7、C恒温水浴箱内低渗处理25分钟。3.低渗完毕，取出离心管，向离心管中加入1ml左右3：1甲醇、冰醋酸固定液进行预固定。1〜2分钟后，每两支离心管成对放在天平上配平,使两支管的重量相等,然后将这两支管对应的放入离心机内的孔中，以1500r/min离心5〜8分钟。4.取出离心管，弃去上清液，再加固定液至6〜8ml,用玻璃吸管沿离心管壁吹打，使沉淀的细胞团块在固定液中充分均匀，然后放入37°C水浴箱中固定15〜20分钟。5.再取出离心管，配平后离心5〜8分钟，转速同样为150(h、/min。离心完毕，去掉上清液，再加入51

8、左右的固定液，用吸管吹打，制成细胞悬液。6.取预冷湿玻片一张，用吸管吸取细胞悬液，从：30cm左右的高度滴到载玻片匕再用口吹散滴液，置于酒粕灯上微微火烤，最后放玻片架或玻片盒中晾干。7.将晾干的玻片放入吉姆萨应川液染色缸中，或将玻片平放于桌上，将染液滴在片上染色。染色10分钟后，用蒸馆水或自來水小心冲去染液，电吹风吹干后镜检。三、染色体观察将制