小鼠骨髓细胞染色体标本制备与观察与微核的检验

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1、本科学生综合性实验报告学号：124120469姓名：朱曦鉴学院：生命科学学院专业、班级：12级生物技术实验课程名称：小鼠骨髓细胞染色体标本制备与观察教师：李云海（副教授）开课学期：2013至2014学年下学期云南师范大学教务处编印一．实验设计方案实验序号实验6实验名称小鼠骨髓细胞染色体标本制备与观察与微核的检验实验时间2014年4月18，25日实验室（一）实验目的1.学习并掌握小鼠骨髓细胞染色体的制备方法。2.观察小鼠染色体的形态特征,统计细胞的染色体数目。3.获得大量客观数据的化学物质遗传毒性评价体系。4.了解微核发生的机制；5.掌握微核实验的一般程序和实践意义；6.

2、掌握对实验动物进行药物处理的一般程序；7.掌握进行实验设计的一般程序和规则，并锻炼实践能力。（二）实验原理及实验流程或装置示意图一．实验原理1.骨髓细胞具有高度的分裂增殖能力。因此可以直接得到中期细胞而不必象血淋巴细胞或组织那样要经过体外培养。2.经秋水仙素处理后，分裂增殖中的骨髓细胞由于纺缍体的形成受到抑制，染色体不能正常趋向两极而使之停留于中期，同时染色体缩短，轮廓清晰，把收获的细胞进行低渗，固定处理，使细胞处于膨胀状态，再将细胞悬液滴在预冷的载片上，使细胞破裂，染色体散开，染色后即可观察到染色体。3.在化学物质中，有很多能引起染色体的异常。染色体是遗传物质的载体并

3、含有生物体全部的遗传信息，染色体遗传信息的异常可不同程度地影响生物机体的生存。轻者突变，重者死亡。同样，对人类就会引起各种疾病和损害。对肿瘤细胞的详细研究表明，大多数肿瘤细胞都存在染色体异常因此，染色体仅出现微小的异常变化，都可能对人体健康产生非常严重的影响。4.检验化学物质能否诱发染色体异常，目前有许多种评价方法。微核的观测是一种直接有效的方法；5.微核（Micronucleus）：微核主要是由外界损害因素(生物、物理、化学)作用致使细胞染色体丢失或断裂，在有丝分裂后期丧失着丝粒的染色体断片或染色体因纺锤体受损而在分裂过程中行动滞后，分裂末期不能进入主核，形成了主核之

4、外的核块，而在细胞浆中形成1个或数个独立于主核、直径小于主核的1/3、染色与主核一致但比主核淡的核小体，因比主核小，故称为微核。微核率的大小与作用因子的剂量或辐射累积效应呈正相关。6.凡能使染色体发生断裂或使染色体和纺锤体联结损伤的化学物，都可用微核试验来检测。各种类型的骨髓细胞都可形成微核，但有核细胞的胞质少，微核与正常核难以鉴别。嗜多染红细胞是分裂后期的红细胞由幼年发展为成熟红细胞的一个阶段，此时红细胞的主核已被排出，因胞质内含有核糖体，Giemsa染色后呈灰蓝色，成熟红细胞的核糖体已消失，被染成淡桔红色。骨髓中嗜多染红细胞数量充足，微核容易辨认，而且微核自发率低，

5、因此，骨髓中嗜多染红细胞成为微核试验的首选细胞群。7.本法用Giemsa染色法观察嗜多染红细胞的微核，嗜多染红细胞呈灰蓝色，成熟红细胞呈粉红色。典型的微核多为单个的、圆形、边缘光滑整齐，嗜色性与核质一致，呈紫红色或蓝紫色，直径通常为红细胞的1/20～1/5。二．实验步骤1.处理：用1.5mg/kg体重剂量，腹腔注射对二甲苯处理小鼠。本次实验的注射量为0.1ml/10g体重，即用上述配制的对二甲苯溶液按每10g体重注射0.1ml（每只小鼠按30g体重计算，注射0.3ml，含对二甲苯0.045mg）。注射24小时后，可以取骨髓。2.处死及收集骨髓细胞：（1）断颈法处死小鼠。

6、剪刀剪开腿部的皮肤，用镊子夹住小鼠的股骨，剪去股骨周围的肌肉，将小鼠的两股骨取出(注意股骨的完整性)，擦净股骨上的肌肉。（2）去股骨的髋面，将吸有2.2%柠檬酸三钠溶液的小注射器的针头插入，反复数次吹出骨髓细胞，反复吹打直至股骨呈白色(注意吹干净，充分收集骨髓细胞)，制成细胞悬液。3.低渗：将细胞悬液在1000rpm/min离心5min，弃除上清液，留0.5ml摇匀。向细胞液中再加入1%的柠檬酸三钠溶液5ml，用吸管轻轻吹打均匀，在室温下低渗30min。低渗期间，配制固定液，即甲醇：冰醋酸为3:1（v/v)，置4℃冰箱中备用。4.预固定(第1次)：低渗处理后的细胞悬液离

7、心5分钟，留1ml原液，摇匀。加入新配制的固定液至6ml，吹打均匀，固定5分钟，再在1000rpm/min离心3-5min，去掉上清液。5.固定（第2次）：沿离心管壁慢慢加入新配制的固定液6ml，用吸管轻轻吹打均匀，室温下固定5min，1000rpm/min3min，弃去上清；如此反复固定两次（共固定3次）。6.细胞悬液：根据管底细胞量的多少，加入新配制的固定液0.3~0.8ml，用吸管打均匀，使其形成细胞悬液。7.滴片：将预冷的载玻片（0℃冰浴），水平或倾斜45°角放置，用吸管吸取细胞悬液，从约0.5~1m高处滴1~2滴到片子上，用口将