人类新型疱疹病毒(HumanHerpesvirus)感染及其对宿主基因组表达状态的影响.pdf

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1、李田：山东大学博士论文摘要人类疱疹病毒(HHV)是近年来新发现的一类主要感染人体淋巴细胞且能诱发多种疾病的DNA病毒，为深入探讨HHV的感染及其对宿主基因组表达的影响，苯课题采用聚合酶链反应(PCR)及RT—PcR技术、原位杂交技术、基因测序技术与流式细胞检测技术(FACS)，首先获得了HHV在健康人群与血液肿瘤患者中感染情况的较大样本调查结果及HHV感染影响宿主细胞分化的分子依据，进而对HHV对宿主细胞周期及其相关蛋白和细胞凋亡的影响进行了比较系统的研究。／1．采用外周血PeR、血清PCR、原位杂交和基因测序等分子生物学技术对较大样本的外周血标本进行了lIHV一6和HHV一7DN

2、A的检测。其中包括80例健康人、i90例各类血液肿瘤患者的外周血标本以及一定数量的骨髓标本。对外周血PBMC所作的PCR结果表明，在健康人血液标本中HHV一6和HHV一7的检出率为21．2％和33．8％，而未化疗的血液肿瘤患者的感染率则为39．7％和45．2％，化疗后提高到47．7％和50．o％。在分型白血病外周血标本中，AML和淋巴瘤与HHV一6感染相关性显著，感染率分别提高至41．6％和50．O％，说明ALL和CML与HHV一6和HHV一7感染具有相关性，而CLL似与病毒相关性不大。在健康人血清中未检出HHVONA，而急性发作的白血病病例中，则有少数病例的血清检出病毒基因序列，

3、说明白血病急性发作时，HHV有可能被激活。对HHV的感染及其感染状态通过随机引物进行原位杂交和PCR片断测序进一步作了证实，确认了健康人和血液肿瘤患者的外周血淋巴细胞、骨髓中都存在HHV-6和HHV一7DNA的潜伏感染。测序结果确证了在济南地区的HHV一6和HHV一7感染株的序列主要为Gs株和眦株，其PCR扩增序列与Internet检索结果吻合率为99．9％。在不同的血液肿瘤中以及血液肿瘤化疗前后，HHV的感染水平和活跃程度都有不同，且HHV一6与HHV一7的感染情况也不相同。以上结果表明，HHV感染与血液肿瘤具有密切牵田：山东大学博士论文的相关性，可能对血液肿瘤的发生发展起着重要

4、的作用。2．采用FACS检测了健康人和各类血液肿瘤病人外周血和骨髓淋巴细胞分化抗原，以测知外周血中各种重要淋巴细胞亚群的变化，主要包括T淋巴系的CD3、CD4和CD8，B细胞系的CDl9，NK细胞系的CDl6。结果发现感染HHV的健康人外周血和骨髓标本的各种淋巴细胞系均无明显变化．感染HHV一6的血液肿瘤患者各种淋巴细胞的数量大部分有显著下降，显示机体对肿瘤细胞免疫水平的广泛下降和免疫功能的损伤．感染HHV一7的血液肿瘤患者的T系淋巴细胞数量显著下降，但NK及B细胞数量未见显著变化。在感染同种病毒的患者中，依肿瘤分型的不同，淋巴细胞的变化也有所区别。这些异常现象在血液肿瘤患者骨髓和

5、外周血的检测中具有一致性。以上实验结果显示HHV的感染在病理情况下可以使淋巴细胞表面分化抗原表达发生显著变化，对T、B和NK等各种免疫细胞的成熟均有所影响，说明HHV具有导致细胞分化异常的能力，即具有致瘤潜力。3．利用FACS技术，我们对HHV感染对健康人及血液肿瘤患者的淋巴细胞细胞周期是否产生影响进行了研究．结果发现，感染HHV的健康人的骨髓细胞周期较未感染者无显著区别。但是将感染HHV的骨髓标本分离B)mVlC后维持培养72hr，培养细胞的细胞周期较未感染对照发生显著变化：s期和G2一M期细胞比例增加，而G0一G1期细胞有所下降。其中HHV一6感染的细胞s期增加显著，而HHV一

6、7感染的细胞s期和G2一M期的细胞增加均显著。显示感染HHV的B删c增殖旺盛．感染HHV的AML患者与未感染AML患者的骨髓细胞进行比较，细胞周期的异常表现在PI指数有所增高，Go—G1期细胞显著减少，G2一M期细胞显著增加，但是s期细胞变化不显著，显示感染HHV的AML骨髓细胞增殖旺盛，且处于分裂期的细胞显著增多，趋向于促进病理情况进一步急变。通过FACS检测了感染HHV的AML患者骨髓细胞的周期和周期相关蛋白一一抑癌基因p16和I)53的表达产物，发现HHV的感染与这两种蛋白有一定联系，如HHV一6对于p53基因的表达水平的降低，HHV一7对于p16基因的表达降低均具有一定程度

7、的相关性。结果表明，HHV一6和HHV一7在体外维持培养及AML李田：山东大学博士论文患者的骨髓标本中，均可造成细胞周期或细胞周期调控蛋白的显著变化。同时两种病毒对比检测的结果也显示了HHV一6和HHV一7在影响细胞周期的程度和途径上有所不同。这一发现提示，HHV在健康人PBMC中呈潜伏感染状态时，免疫系统会清除因HHV感染造成的异常细胞，在免疫水平低下或异常时，HHV可造成细胞大量增殖，制造有利于自身复制的环境．HHV的感染还与某些细胞周期相关的宿主抑癌基因表达降低