细胞工程实验指导.doc

《细胞工程实验指导.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、实验一动物细胞培养细胞培养是用无菌操作的方法将动物体内的组织(或器官)取出，模拟动物体内的生理条件，在体外进行培养．使其不断地生长、繁殖，人们借以观察细胞的生长、繁殖、细胞分化以及细胞衰老等过程的生命现象。细胞培养的突出优点，一是便于研究各种物理、化学等外界因素对细胞生长发育和分化等的影响；二是细胞培养便于人们对细胞内结构(如细胞骨架等)、细胞生长及发育等过程的观察。因而细胞培养是探索和指示细胞生命活动规律的—种简便易行的实验技术，同时我们也不可忽略的另一个因素，那就是它脱离乐生物机体后的—些变化。细胞培养技术目前已广泛地被应用于生物学的各个领域。如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免

2、疫学、肿痛学及病毒学等为此有必要使学生在细胞培养方面得到一些初步的感性知识，了解动物细胞培养的基本操作过程，观察体外培养细胞的生长特征，对原代细胞与传代细胞有一个基本概念。本实验分两次进行．即清洗与消毒和传代细胞的培养与观察。Ⅰ清洗与灭菌一、实验目的能独立地进行用于细胞培养的各种器皿的清洗与消毒，掌握干热灭菌法、湿热灭菌法和滤过除菌法的操作，了解化学消毒法的使用方法。二、实验原理清洗与消毒是组织培养实验的第一步，是组织培养中工作量最大，也是最基本的步骤。体外培养细胞所使用的各种玻璃或塑料器皿对清洁和无菌的要求程度很高。细胞养不好与清洗不彻底有很大关系。清洗后的玻璃器皿，不仅要求干净透

3、明，无油迹，而且不能残留任何物质。如有毒的化学物质，哪怕残留0．1个，也可能影响细胞生长。灭菌手段的选择十分重要，对不同的物品需采用不同的灭菌方法。假如选用的方法不对，即使达到了无菌却使被灭菌药品丧失了营养价值、生物学特性或其他使用价值也不行。以下在每种灭菌步骤中都介绍其使用范围。三、实验材料、用品材料：无臭氧型紫外灯，微孔滤膜(直径25)：孔径为0．22μm，微孔滤膜(直径90)：孔径为0．22μm，过滤器(直径25)。药品：70％或75％酒精，0．1％新洁尔灭，煤酚皂溶液(来苏儿水)，0．5％过氧乙酸，乳酸，37％甲醛，高锰酸钾，NaOH，盐酸，重铬酸钾，浓硫酸(工业)，DEPC

4、水[体积分数0．1％的焦炭酸二乙酯(diethylpyroearbonate)]。仪器：超净台，干燥箱，高压锅，过滤器，过滤泵。四、实验步骤(一)清洗1．新玻璃器皿的清洗先用自来水刷洗，再浸泡5％稀盐酸以中和玻璃表面的碱性物质和其他有害物质。2．使用过的玻璃器皿的清洗(1)使用过的培养用品应立即浸入清水，避免干涸难洗。(2)用洗涤剂清洗玻璃器皿，自来水清洗数遍，倒置自然干燥。(3)浸酸性洗液过夜。(4)从酸性洗液捞出后自来水冲洗10．15次去除残余酸液，蒸馏水涮洗3次，倒置烘干。(5)包装(牛皮纸或一般纸)。(6)高压(15磅20min)或干热(170℃2h)灭菌。(7)贮存备用。3

5、．胶塞的处理(1)新胶塞应先用清水清洗之后再用0．2％NaOH煮沸lO-20min。(2)自来水清洗10次。(3)再用1％稀盐酸浸泡30min。(4)自来水清洗10次，蒸馏水涮洗3次。晾干，高压灭菌(见(二)消毒与灭菌)。旧胶塞不必用酸碱处理可直接用洗涤剂煮沸和清洗数次，过蒸馏水，晾干，包装并高压灭菌后，便可使用。（二）消毒1．物理消毒法(1)紫外线消毒用于消毒空气、操作台面和一些不能用干热、湿热灭菌的培养器皿，如塑料培养皿、培养板等。这是常使用的消毒方法之一。(2)干热灭菌主要用于玻璃器皿的灭菌。将用于细胞培养的器皿放人干燥箱内，加热至160℃，保温90－120min。用于RNA提

6、取实验的用品则需180℃，保温5－8h。(3)湿热灭菌此方法也称为高压蒸汽灭菌，是最有效的一种灭菌方法。主要应用范围是布类、橡胶制品(如胶塞)、金属器械、玻璃器皿、某些塑料制品以及加热后不发生沉淀的无机溶液(如Hanks液、PBS、20×SSC等)。手动高压灭菌锅操作如下：①首先查看高压锅内的水是否充足，放人物品盖好盖。②加热高压锅。将放气阀打开，放气5—10min，以排除锅内的冷空气。③待锅内水沸腾后，落下放气阀继续升温升压，玻璃器皿等用15磅(121℃)30min，胶塞、塑料制品、溶液等可用10磅(115℃)20min。调节火力大小保持该压力。④停止加热，待压力自然下降至0再打开

7、放气阀排汽，开盖，取出高压灭菌的物品烘干。电热自动灭菌锅使用说明(型号：SANYOAutoclaveMLS-3020)：①放气筒加水至LOW水平线处，将与高压锅相连的导气管插入放气筒里，然后将放气筒归于原位。②打开高压锅盖，加入蒸馏水至高压锅底的水位线，水位线位于V型凹槽的1／3－2／3处。③打开电源。④设定高压温度及时间，高压锅的温度范围为105－121℃，高压灭菌一般采用121℃20—30min。⑤把待高压的物品置于高压锅内，顺时针方向将exhaust