植物细胞工程实验指导修改

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1、广东塔裁育斤唾点实验室——观代玄扬技术实瞼室实瞼教材植物细胞工程实验指导陈远玲李静编著华南农业大学现代生物技术实验室植物细胞工程分室2005年2月编者的话这木教材是为广东省教冇厅重点实验室——现代生物技术实验室屮植物细胞工程实验课程编写的，所开实验而向石牌地区六所高校的高年级本科生和本校研究生。木课程总学吋52.5。实验一至六及实验八为木科生课程内容；实验一至七及实验九为研究生课程内容。在实验内容选择上，兼顾不同专业、不同层次学生的要求，既有较为实用化的技术如快繁、微茎尖培养脱薄、细胞悬浮培养等技术，也冇研究性较强的技术如原生质体培养、细

2、胞融合、遗传转化等技术,力争使选课者对植物细胞工程技术有一个较全面的了解和掌握。各校选课者可根据白己的需要选修其中的内容。在实验顺序安排上，遵循山易到难的原则，山培养基配制一器官培养一组织培养〜细胞培养一原生质休培养一细胞触合一遗传转化。木教材是在总结我室多年的研究经验和成果，以及多年来对研究生和本科生开课经验的基础上写成的。教材的最初版本写于1996年，2000年作了部分修改。为了适应新的教学需要，培养学生进行研究性学习的能力，这次编写对实验内容作了较大增改，并提高了教学要求。近年来我们对研究生试行3期开出了5个、本科牛•试行1期开出了

3、4个综合设计性实验，取得了很好的教学效果。在本次改编时，正式编写了6个综合设计性实验（实验2、3为综合及设计性实验；实验6—9为综合性实验）。有能力、感兴趣的学生可白行设计试验，探索有关的科学问题或解决牛产实际问题。我们衷心希望本书的使用者提出宝贵意见，以使本课程教学收到更好的效果。编者2005年2月实验一培养基的配制与灭菌1实验二愈伤组织的诱导与分化5实验三几种植物快速无性繁殖方案的探索7实验四微茎尖脱毒培养12实验五植物细胞悬浮培养14实验六植物原生质体游离与培养16实验七植物细胞融合19实验八植物遗传转化——基因枪法21实验九植物遗

4、传转化——农杆菌介导法24附录1植物组织培养常用培养基27附录2常用激素的溶解28附录3常用消毒剂的使用和效果28附录4水稻原生质体培养所用洗液及培养基29附录5SartoriusPB-10型酸度计简明操作指南31参考文献32实验一培养基的配制与灭菌一、目的掌握植物培养棊的棊木成分及其作用；掌握植物培养棊的配制方法；掌握培养基及各种用具的灭菌方法二、原理（一）培养基在植物组织培养过程中，外植体生长所必需的营养成分、生长因子、理化环境等主要由培养基捉供。不同材料对培养基的要求不尽相同，适当地设计和选用培养基，对组织培养取得成功是至关重要的。

5、另外，纽织培养物的脱分化、分化等状态的调控，次牛代谢物的产出等都要通过调节培养基成分来实现。培养基实际上是一个人工模拟的植物生长、发冇环境，它通常包括下列成分（表1）:表1培养基的纽成成分及其作川类别成分作用无机盐大量元素：N、P、K、Ca、Mg、S微量元素：Fe>B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl、I、Co等植物牛长所必需的营养元素冇机物营养物：糖类、氨基酸及酰胺类生理活性物：维生素等为植物细胞捉供C、H、0、N等必要元素；作为生理活性物质在细胞代谢中起一定作用；糖类还可调节培养基的渗透压植物生长调节剂植物天然的五类激素及其人工合成的类似

6、物作为牛理活性物质参与植物牛长发育的调节，是细胞信号转导网络中重耍的化学信号分子附加物如琼脂、活性C等固化剂可使外植体固着、定位生长；活性C可吸附外植体所分泌的有害物质，利于细胞生长其他未加复合成分如椰了水、酵母提取物、香蕉、西瓜水、马蹄汁供给一些必要的微量营养成分、生理活性物和生长激素等，缓冲pH值几种常见的培养基配方见附录1。配制培养棊可以直接称量。但为了提高称量的准确性并减少多次称量的麻烦，通常都按配方浓度的若干倍称虽，配制成一系列的母液置于冰箱保存，用时按比例稀释。一燉要配下列母液：1.微蜃元素母液：除铁盐外的其他微蜃元素盐类的混

7、合液，配成1000倍母液。2.有机化合物母液：除肌醇外其他有机成分的混合液，配成1000倍母液。3.铁盐母液：铁盐与其他无机成分混合易产生沉淀，须单独配制。通常与Na2EDTA配成100倍的螯合铁盐母液。4•激素母液：各种激素单独配制成母液，浓度从0.1mg/mL到LOmg/mL不等。各种激素的溶解见附录205.10倍培养基母液：培养基配方中除激索、糖、固化剂外，其他成分（大量元索、微虽元索、冇机成分、铁盐、肌醇等）混合配成10倍液1000mL,等分为10瓶，置于冰箱冷冻保存。用时取1瓶该母液,加入激素、糖、固化剂等成分配成1000mL即

8、可。此法方便快捷，但某些配方（如KC培养基）中有些成分溶解度很小，不能配成10倍母液。培养基的pH值会影响卅i物对养分的吸收与利用，述会影响琼脂等固化剂的凝固，因此培养基必须调至一定的pH值。