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1、动物细胞工程实验指导1实验一培养用液的配制、除菌与分装【实验冃的】1.掌握常见培养用液的配制方法。2.掌握常用的灭菌方法。3.了解每种培养用液的作用。【实验原理】常用细胞培养用液包括磷酸盐平衡盐溶液(PhosphateBufferedSaline,PBS)、液体培养基、胰蛋白酶(Trypsin)和EDTA溶液。PBS用于清洗细胞、配制胰蛋白酶和EDTA。培养基含有细胞生长需要的各种营养元素，使用时通常还需填加血清和抗生素。鱼类细胞培养的培养基常用种类是MEM和L-15；用于动物的一般是DMEM和RPMI-
2、1640o胰蛋白酶可将贴壁的细胞从培养瓶壁上消化下来，通常使用浓度为0.25%或0.125%oEDTA用于清洗细胞表面，螯合Ca2+等二价离子，使细胞易于为胰蛋白酶消化。细胞培养用的试剂必需是无菌的，PBS和EDTA可以采用高压灭菌，而培养基和胰蛋白酶溶液含生物活性物质，配制好后通过过滤除菌。【试剂、材料与仪器】试剂：NaCI,KCI,Na2HPO4,KH2PO4,EDTA,胰蛋白酶，HEPES,碳酸氢钠，盐酸，MEM或PRMI-1640培养基干粉，GPS材料：三蒸水，蒸馆水瓶，药匙，称量纸，烧杯(250
3、mL.1000mL),玻棒，精密pH试纸(6.8-8.0),容量瓶(250mL、1000mL),移液管(5mL>10mL),一次性注射器，一次性过滤器，普锡，酒精灯，打火机，医用酒精，酒精喷壶，消毒纱布，己高压灭菌试剂瓶(500mL、250mL、100mL),记号笔，标签纸，橡胶手套，封口膜仪器：精密天平，高压灭菌锅，超净工作台，加液枪，4°C冰箱【实验分组】实验分组进行，每组4人，每班20人，共分5组。配制PBS并高压灭菌，配制胰蛋白酶溶液并过滤除菌和分装，配制EDTA溶液高压灭菌并分装，配制培养基，过
4、滤除菌培养基并分装。每个实验小组需准备试剂有：胰酶50mL；EDTA50mL；培养基90mL(使用前加入10mL血清)。【实验步骤】1.PBS(lOOOmL)的配制分别称取NaCI8g；KCI0.2g；Na2HPO4•12H2O2.9g；KH2PO40.2g于烧杯，加入800mL三蒸水，玻棒搅动充分溶解后，倒入lOOOmL容量瓶中，用三蒸水定容至刻度。PBS用于2胰蛋白酶溶液和3EDTA溶液的配制，余下高压灭菌备用。22•胰蛋白酶溶液(0.25%)的配制、除菌与分装称取0.625g胰蛋白酶于250mL烧杯
5、，加入1配制的PBS200mL,玻棒搅拌充分溶解后，倒入250mL容量瓶中，用PBS定容至刻度。拿入超净工作台过滤除菌，并分装至5个试剂瓶(100mL),每瓶50mL。试剂瓶均在酒精灯火焰上烧口加盖，贴好标签，封口膜封口，放4°C冰箱保存备用。标签上标明：0.25%胰蛋白酶液、配制日期、以及组号与组长姓名。3.EDTA(0.2%)的配制、除菌与分装称取0.5gEDTAT250mL烧杯，加入1配制的PBS200mL,溶解时加少量NaHCO3，调整pH为8.0,玻棒搅拌使EDTA充分溶解。再用PBS定容到25
6、0mL容量瓶里，终浓度为0.2%,用浓盐酸，调pH为727.4。装r250mL试剂瓶中，高压灭菌备用。在超净工作台内，将已灭菌的EDTA溶液分装至5个无菌试剂瓶(100mL),每瓶50mLo试剂瓶均在酒精灯火焰上烧口加盖，贴好标签，封口膜封口，放4°C冰箱保存备用。标签上标明：0.2%EDTA.配制日期、以及组号与组长姓名。4•培养基的配制、除菌与分装将培养基干粉(MEM或PRMI-1640)倒入1000mL烧杯，力H800mL三蒸水，玻棒搅拌充分溶解；再加入加1.8gHEPES和2.2g碳酸氢钠，玻棒搅
7、拌充分溶解，溶液呈橙色(弱酸性，pH在7.0左右)；再倒入1000mL容量瓶，用三蒸水定容至刻度。工作前打开超净工作台上的紫外灯，灭菌30分钟后，关闭紫外灯，打开吹风和照明灯；带橡胶手套，用酒精擦拭消毒双手；超净工作台面用酒精喷洒，再用消毒纱布擦净。在超净工作台中摆放好试剂瓶和滤器。将培养液拿入超净工作台过滤除菌，并分装至5个无菌试剂瓶(100mL),毎瓶90mL,余下装入500mL无菌试剂瓶，每瓶内需加入无菌的GPS(谷氨酰胺■青霉素■链霉素)，轻轻摇匀，使之终浓度为1%。试剂瓶均在酒精灯火焰上烧口加盖
8、，贴好标签，封口膜封口，放4°C冰箱保存备用。标签上标明：MEM或PRMIJ640、配制日期、以及组号与组长姓名。用于细胞培养时，培养基内需要加入血清，生长培养基内血清浓度为10%O【注意事项】1.滤过除菌时，将容量瓶内的液体倒入烧杯内，再拿到超净台里，釆用一次性滤器或是抽滤法除菌。2.培养基中的抗生素可在配置时加入青霉素和链霉素的粉末，也可在过滤除菌后加入无菌的液体，终浓度为100U/mL青霉素和100Pg/mL链霉素。【思
