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《烟叶微生物产酶对提高烟叶质量及缩短陈化期的作用.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。
1、烟叶微生物产酶对提高烟叶质量及缩短陈化期的作用烤烟叶面优势微生物产的几种水解酶的产生和温度稳定性研究摘要为了研究将复合微生物，复合微生物酶应用于烟草进行人工醇化，我们研究了烟叶优势微生物产的水解酶(β,淀粉酶，糖化酶，果胶酶，CMC酶，蛋白酶)的产生与温度稳定性。结果表明，2,烟叶水为基本培养基，适当添加少量诱导物(0.2%)，对于碳水化合物类生物大分子降解酶类的产生具有一定的诱导作用。60度保温时，反应温度越高，酶活越高;相同反应温度时，保温温度越高，酶活越高.60度下，酶易失活。关键词烟叶醇化诱导物酶稳定性烤烟醇化(陈化)需要2,3年，
2、这期间的反应主要由于酶的作用，化学作用和微生物作用【1】.微生物产酶应用于烟叶陈化，一可以缩短烟叶醇化的周期，二可以提高烟叶的内在品质.人们研究认为纤维素，果胶，淀粉，蛋白质的含量在一定范围内与烟叶的质量呈负相关【2】.目前国内已见报道利用成品酶改变烟叶的化学成分，提高烟叶质量【2，3，4】.还有研究报道了陈化期间烤烟叶面微生物的变化趋势【5，6】.我们已经连续2年对陈化期间的烟叶取样，进行了烟叶微生物菌种分离，纯化，鉴定及优势微生物菌株所产的酶类鉴定.我们现有的结果说明，存储烟叶表面存在大量的微生物，细菌，霉菌，酵母菌均有不同程度存在.我
3、们的目的是利用复合微生物，复合微生物酶对烟草进行人工醇化.本文研究了几株微生物降解酶类的产生及其酶的稳定性，为人工醇化烟草奠定了理论基础.1材料和方法1.1实验材料1.1.1菌株:连续两年取陈化期间的烟叶，筛选微生物，普测β,淀粉酶，糖化酶，果胶酶，CMC酶，蛋白酶的活性.选出产酶活性高的菌株.1.1.2烟叶:山东B2F，取自济南将军集团储藏库1.2仪器:UNICOUV-2000全波段分光光度计1.3实验方法1.3.1培养方法:非诱导培养:用1,烟叶抽提物配制牛肉膏蛋白胨培养基,,,,接种摇床培养,,,,,,，转接到,,烟叶水100,,三角
4、瓶中，摇床继续培养,,,,诱导培养:用加有0.2,诱导物的1,烟叶抽提物配制牛肉膏蛋白胨培养基,,,,接种摇床培养,,,,,,，转接到加有0.2,诱导物的,,烟叶水,,,,,三角瓶中，摇床继续培养,,,,(测定淀粉酶，糖化酶，果胶酶，CMC酶，蛋白酶时的诱导物分别为可溶性淀粉，可溶性淀粉，果胶，CMC,酪蛋白。1.3.2酶活测定方法:1.3.2.1β-淀粉酶:培养液8000,10000rpm5min，取适当离心发酵液1ml，25度放置;乙酸缓冲液(pH,4.8)制备的1,可溶性淀粉1ml,25度放置。将两者混合于25度酶解3分钟，加入1.5
5、mlDNS,沸水浴6min，稀释反应液至25ml，振荡混匀在540nm下测定光吸收，平行3管。空白样品用灭活10min的发酵液.以每1ml酶液每min生成1微mol麦芽糖作为一个酶活单位.(标准曲线用2mg/mol的麦芽糖)1.3.2.2糖化酶:用1%可溶性淀粉溶液作底物.将1ml酶液与1ml底物溶液在50?水浴调温，待温度平衡后混匀反应10min，加入1.5mlDNS，沸水浴加热5min.自来水冷却后蒸馏水补充到25ml,在540nm处比色测定.空白对照用灭活酶液.以每1ml酶液每小时生成,,,,还原糖作为一个酶活单位.1.3.2.3CM
6、C酶:CMC溶液，羧甲基纤维素钠用pH=4.8的0.1M的醋酸缓冲液配成1,的溶液.测定时加入1.5ml再加入500μl酶液摇匀，50?保温30min，加入1.5mlDNS，煮沸6min，补充蒸馏水至25ml，用550nm分光光度计测定.空白对照用灭活酶液.通过葡萄糖标准曲线，以每1ml酶液min生成1微mol葡萄糖作为一个酶活单位.1.3.2.4果胶酶:0.2ml酶液+0.6ml0.2mol/LpH4.2的HAc,NaAc缓冲液，0.2ml1,底物(果胶)，混匀，50度水浴保温30min，取出，冷水浴中止反应，加入1mlSomogyi甲液
7、，放入沸水浴中煮沸10min，加入1.0mlSomogyi乙液，定容至10ml.于560nm处比色.对照:酶和缓冲液，底物同时保温30min，之后混合.以每1ml酶液每min生成1微mol半乳糖醛酸作为一个酶活单位.(标准曲线用0.5mg/ml的半乳糖醛酸)1.3.2.5蛋白酶:取5ml酪蛋白溶液加入试管中,在37?水浴上平衡5min，加入0.1ml酶液.在37?水浴上振荡培养10min，加三氯乙酸溶液终止反应，静置15min，用WhatmanNo.42滤纸过滤.在波长280nm处测定光吸收(1cm)光径。空白对照:在底物溶液中先加三氯乙酸
8、，再加酶液，其余步骤同上.在上述条件下，每1ml酶液每分钟A280nm产生0.001变化所需要的酶量定义为一个酶活单位.(A-Al)*10想对活性,0.001*10(U/m1)A
