载体构建操作流程.doc

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1、载体构建操作流程一、载体准备1、质粒准备电泳检测载体质量好的质粒为三条带，分别是超螺旋、开环和复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起）；也有观点认为是质粒两条链没有断裂的超螺旋结构，开环DNA和线性DNA。超螺旋结构应至少占到90%。测定质粒浓度用核酸定量仪测定质粒的浓度，A230、A260和A280值。2、质粒双酶切根据需要的酶切位点，选择对应的酶，查找适合的Buffer，进行单酶切。以TaKaRa的限制酶为例，双酶切的体系如下：试剂体积质粒<1μgEnzymeI1μLEnzymeII1μL

2、10×XBuffer2μL灭菌水to20μL总体积20μL将上述体系置于37℃（不同酶可能存在差异）水浴锅中酶切。根据酶切效率不同确定酶切时间，可以去除2μl进行电泳检测。3、回收质粒凝胶回收参照TaKaRaMiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKitVer.3.0试剂盒说明书。1)称量胶块重量，计算胶块体积。计算胶块体积时，以1mg=1μl进行计向胶块中加入胶块融化液BufferGM，我们一般用1%的琼脂糖凝胶电泳，所以一般加入3个凝胶体积量。2)均匀混合后室温15-25℃融

3、化胶块。此时应间断振荡混合，使胶块充分融化（约5～10分钟）。3)将试剂盒中的SpinColumn安置于CollectionTube上。将上述操作的溶液转移至SpinColumn中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。滤液再加入SpinColumn中离心一次，可以提高DNA的回收率。4)将700μl的BufferWB加入SpinColumn中，室温12,000rpm离心30秒钟，弃滤液。5)重复操作步骤。6)将SpinColumn安置于CollectionTube上，室温12,000rpm离心1分钟

4、。7)将SpinColumn安置于新的1.5ml的离心管上，在SpinColumn膜的中央处加入30μl的灭菌蒸馏水或ElutionBuffer，室温静置1分钟。8)将灭菌蒸馏水或ElutionBuffer加热至60℃使用时有利于提高洗脱效率。9)室温12,000rpm离心1分钟洗脱DNA。4、检测取1μl凝胶回收产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测条带大小与目的大小是否一致。用核酸定量仪测回收片段的浓度。二、插入片段准备1、两端带有酶切位点的PCR产物如果设计的扩增目的片段的引物带有酶切位点及相应的保护碱基

5、，可以采用限制酶进行双酶切，具体参考质粒双酶切的体系及鉴定方法。2、寡核苷酸（包括shRNA和linker）如果要构建shRNA载体，那么需要合成shRNA上下游寡核苷酸引物。引物回来之后，首先根据说明书上提供的信息，用水溶解到终浓度为1μg/μl。引物退火试剂体积F2R2H2O46在PCR仪上进行引物退火，退火体系设置为90℃3min，37℃1hr。结束之后马上进行连接，或者冻到-20℃保存。三、连接我们实验室采用的是FermentasT4DNALigaseEL0014kit1、粘性末端连接按照下面

6、体系进行加样ComponentAmountLinearvectorDNA20-100ngInsertDNAmolarratioovervector（1:1to5:1）10XT4DNALigaseBuffer2µlT4DNALigase（5u/µl）1u（0.2µl）Water,nuclease-freeto20µlTotalvolume20µl在PCR仪中22℃孵育10min，可根据片段大小适当调整连接时间。取5µl连接产物进行转化50μl感受态细胞，剩下的保存备用。2、钝性末端连接按照下面体系进行加

7、样ComponentAmountLinearvectorDNA20-100ngInsertDNAmolarratioovervector（1:1to5:1）10XT4DNALigaseBuffer2µlT4DNALigase（5u/µl）5u（1µl）50%PEG4000Solution2µlWater,nuclease-freeto20µlTotalvolume20µl在PCR仪中22℃孵育1hr，可根据片段大小适当调整连接时间。取5µl连接产物进行转化，剩下的保存备用。3、载体连接linker按照

8、下面体系进行加样ComponentAmountLinearvectorDNA100-500ng磷酸化的linker1-2μg10XT4DNALigaseBuffer2µlT4DNALigase（5u/µl）2u（0.4µl）50%PEG4000Solution2µlWater,nuclease-freeto20µlTotalvolume20µl充分混匀，短暂离心后，放在PCR仪中22℃孵育1hr，65℃放置10min使酶失活。取5µl连接产物进行转化，剩