构建载体的步骤.doc

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1、构建载体的步骤：NCBI数据库中找到目的基因的序列根据序列用软件Primer5设计引物，让公司合成（需要几天时间）注意：设计引物有几条注意事项：1、从质粒上扩增目的基因，引物只需要简单设计，并加上两端的酶切位点即可。2、从基因组上或者从cDNA上扩增基因，需要仔细考虑引物的长度及引物二聚体、错配等的可能性（软件设计的时候均会显示）3、另外，酶切位点的设计需要综合考虑：首先，目的基因序列上应该没有，载体上应该有，但是只能有一个而不是多个~从细胞中提取RNA，反转录成cDNA，作为PCR的模板利用合成的引物，模板进行PCR，小规模（20ul体系

2、）扩增目的基因利用琼脂糖凝胶电泳检测目的基因的大小是否正确若正确，则大规模（50ul体系）扩增目的基因，然后电泳后切胶回收将回收后的产物和骨架载体进行酶切根据酶切产生的多余片段的大小进行溶液回收或者切胶回收将回收后的产物进行连接将连接产物转化涂板从LB平板上挑几个单克隆进行培养提质粒送测序（需要几天时间）将测序结果与所找到的目的基因的序列进行比对，看是否有突变若有突变，则比对氨基酸序列，只要氨基酸序列一致，载体即构建成功。