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载体构建基本步骤.doc

载体构建基本步骤.doc

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时间：2020-01-23

载体构建基本步骤.doc_第1页
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1、载体构建基本步骤1.选定目的基因，设计特异性引物，利用高保真酶进行PCR扩增2.对扩增结果进行琼脂糖凝胶电泳检测（1%）,若检测结果正确，测序结果之后进行胶回收目的片段3.通过平末端连接将目的基因连接到克隆载体（PMD-18T）4.转化DH5α，根据载体抗性涂板37度过夜培养5.挑取阳性克隆进行PCR验证，PCR验证后挑取阳性克隆进行大摇并提取质粒、双酶切，同时取500微升菌液送测序6.测序结果正确后对提取的质粒进行双酶切回收目的片段7.对表达载体用同样的限制性内切酶双酶切之后回收大片段8.将目的片段与表达载体的大片段

2、用T4DNA连接酶连接后转化DH5α，涂板37度过夜9.挑取阳性克隆大摇酶切验证，若结果正确，则载体构建完毕

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