载体构建流程v3

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1、DNA重组技术实验原理、方法和步骤实验原理1．DNA重组技术重组DNA(RecombinantDNA)技术是遗传工程的核心技术，也是人类在基因和DNA分子水平进行操作的技术。它包括以下几个步骤：1）重组DNA分子的构建：即将目的基因（DNA或cDNA片段）与载体DNA重组，应用TA克隆方法,将PCR扩增产物快速克隆至质粒载体中。该方法利用了PCR过程中使用的热稳定聚合酶(Taq酶)在所复制的双链分子末端加上单一脱氧腺苷酸(A),从而产生一A-粘性末端的性质,设计一种线性载体,使之含有一T-粘性末

2、端,可直接插入PCR产物,在DNA连接酶作用下，目的DNA和载体DNA连接形成重组DNA分子。2）将重组DNA分子转化宿主细胞。3）克隆选择增殖：将转化后的液体涂布于琼脂培养基表面，培养基中含有宿主菌敏感的抗生素，重组DNA（TA克隆载体分子）含有相应抗生素的抗性基因，转化的细菌能在培养基上生长形成集落。挑取菌落，置液体培养基中培养，得到大量含重组DNA的细菌。4）收获扩增后的培养细胞，提取重组DNA分子（质粒），并纯化，获得某一基因或DNA片段的大量拷贝。图1TA克隆原理示意图2．质粒DNA的

3、小量制备常见的质粒DNA提取方法有简易一步提取法、碱裂解法和煮沸法。本实验采用的是碱裂解法，碱裂解法的原理：在PH12.0~12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒（CC）DNA仍为自然状态。将pH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构。大部分染色体DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态。通过离心，将可去除大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用乙醇沉淀回收质粒DNA。

4、3．质粒DNA的限制性内切核酸酶（限制酶）切分析限制酶存在于原核生物体内，根据其结构和功能特性分为：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。Ⅰ型切点不固定，Ⅲ型其切割位点在识别位点之外，只有Ⅱ型其特异性切点位置可以控制和预测，可以产生固定的DNA片段，基因工程中所用的限制酶均为Ⅱ型限制酶。这类酶的特点是具有能够识别双链DNA分子上的特异性核苷酸序列的能力，能在这个特异性核苷酸序列内切断DNA双链，形成一定长度和顺序的DNA片段。选择合适的限制酶对重组的环状质粒进行酶切，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，用已知相对分子量的

5、线状DNA（DNA分子量标志）及未经酶切的重组环状质粒为对照，可以对重组环状质粒中的目的DNA分子进行初步鉴定以下格式固定：标题原理操作步骤注意事项试剂货号公司。添加试验失败结果的照片。加入实验原理所有实验，进行前请认真阅读试剂使用说明书关键的准备工作，如试剂选择等（提前预热/预冷相关仪器等）注意事项附在相应操作步骤之后，以五角星标注。。一．RNA反转录cDNARNA防污染措施实验原理：RT-PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从

6、RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。实验材料：试剂盒：TakaraPrimeScript®RTreagentKit实验步骤：实验所用枪头，EP管，水等全部使用RNasefree耗材，或者提前使用DEPC处理。处理方式：按照1/1000比例向无菌水中加入DEPC，将所需耗材在含DEPC的水中浸泡

7、过夜；次日早晨高压灭菌处理。提前调水浴锅至42℃；按下列组份配制RT反应液(反应液配制请在冰上进行)。5×PrimeScript®Buffer(forRealTime)2μlPrimeScript®RTEnzymeMixI0.5μlOligodTPrimer(50μM)0.5μlRandom6mers(100μM)0.5μlTotalRNA360ngRNaseFreedH2Oupto10μltotal10μl轻柔吹打均匀；室温放置10min；42℃水浴锅中放置1h；冰中冷却2min；注意事项：上

8、述反应可根据条件在PCR仪中进行。当需要使用的基因编码的RNA二级结构较为复杂时,反转录前,将RNA溶液于65°C加热5分钟后迅速置于冰中,利用这种办法可以减弱二级结构的影响,提高逆转录反应效率。一．目的基因扩增：引物设计原则：a)特异性：在cDNA中能且只能扩增出目的序列，不会扩增出其他序列；（通过blast检验）b)在引物5’端添加酶切位点及3个保护碱基设计引物时，保护碱基应加到5-10个李积彬；c)酶切位点使用所选载体中有的位点，尽量避免使用载体中相邻的位点，尽量避免使用平末端位点；所选位