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时间:2019-08-10
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1、DNA重组技术实验原理、方法和步骤实验原理1.DNA重组技术重组DNA(RecombinantDNA)技术是遗传工程的核心技术,也是人类在基因和DNA分子水平进行操作的技术。它包括以下几个步骤:1)重组DNA分子的构建:即将目的基因(DNA或cDNA片段)与载体DNA重组,应用TA克隆方法,将PCR扩增产物快速克隆至质粒载体中。该方法利用了PCR过程中使用的热稳定聚合酶(Taq酶)在所复制的双链分子末端加上单一脱氧腺苷酸(A),从而产生一A-粘性末端的性质,设计一种线性载体,使之含有一T-粘性末
2、端,可直接插入PCR产物,在DNA连接酶作用下,目的DNA和载体DNA连接形成重组DNA分子。2)将重组DNA分子转化宿主细胞。3)克隆选择增殖:将转化后的液体涂布于琼脂培养基表面,培养基中含有宿主菌敏感的抗生素,重组DNA(TA克隆载体分子)含有相应抗生素的抗性基因,转化的细菌能在培养基上生长形成集落。挑取菌落,置液体培养基中培养,得到大量含重组DNA的细菌。4)收获扩增后的培养细胞,提取重组DNA分子(质粒),并纯化,获得某一基因或DNA片段的大量拷贝。图1TA克隆原理示意图2.质粒DNA的
3、小量制备常见的质粒DNA提取方法有简易一步提取法、碱裂解法和煮沸法。本实验采用的是碱裂解法,碱裂解法的原理:在PH12.0~12.6碱性环境中,线性的大分子量细菌染色体DNA变性,而共价闭环质粒(CC)DNA仍为自然状态。将pH调至中性并有高盐浓度存在的条件下,染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构。大部分染色体DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀,而质粒DNA仍为可溶状态。通过离心,将可去除大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质,质粒DNA尚在上清中,再用乙醇沉淀回收质粒DNA。
4、3.质粒DNA的限制性内切核酸酶(限制酶)切分析限制酶存在于原核生物体内,根据其结构和功能特性分为:Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。Ⅰ型切点不固定,Ⅲ型其切割位点在识别位点之外,只有Ⅱ型其特异性切点位置可以控制和预测,可以产生固定的DNA片段,基因工程中所用的限制酶均为Ⅱ型限制酶。这类酶的特点是具有能够识别双链DNA分子上的特异性核苷酸序列的能力,能在这个特异性核苷酸序列内切断DNA双链,形成一定长度和顺序的DNA片段。选择合适的限制酶对重组的环状质粒进行酶切,将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测,用已知相对分子量的
5、线状DNA(DNA分子量标志)及未经酶切的重组环状质粒为对照,可以对重组环状质粒中的目的DNA分子进行初步鉴定以下格式固定:标题原理操作步骤注意事项试剂货号公司。添加试验失败结果的照片。加入实验原理所有实验,进行前请认真阅读试剂使用说明书关键的准备工作,如试剂选择等(提前预热/预冷相关仪器等)注意事项附在相应操作步骤之后,以五角星标注。。一.RNA反转录cDNARNA防污染措施实验原理:RT-PCR是将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。首先经反转录酶的作用从
6、RNA合成cDNA,再以cDNA为模板,扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛,可用于检测细胞中基因表达水平,细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。实验材料:试剂盒:TakaraPrimeScript®RTreagentKit实验步骤:实验所用枪头,EP管,水等全部使用RNasefree耗材,或者提前使用DEPC处理。处理方式:按照1/1000比例向无菌水中加入DEPC,将所需耗材在含DEPC的水中浸泡
7、过夜;次日早晨高压灭菌处理。提前调水浴锅至42℃;按下列组份配制RT反应液(反应液配制请在冰上进行)。5×PrimeScript®Buffer(forRealTime)2μlPrimeScript®RTEnzymeMixI0.5μlOligodTPrimer(50μM)0.5μlRandom6mers(100μM)0.5μlTotalRNA360ngRNaseFreedH2Oupto10μltotal10μl轻柔吹打均匀;室温放置10min;42℃水浴锅中放置1h;冰中冷却2min;注意事项:上
8、述反应可根据条件在PCR仪中进行。当需要使用的基因编码的RNA二级结构较为复杂时,反转录前,将RNA溶液于65°C加热5分钟后迅速置于冰中,利用这种办法可以减弱二级结构的影响,提高逆转录反应效率。一.目的基因扩增:引物设计原则:a)特异性:在cDNA中能且只能扩增出目的序列,不会扩增出其他序列;(通过blast检验)b)在引物5’端添加酶切位点及3个保护碱基设计引物时,保护碱基应加到5-10个李积彬;c)酶切位点使用所选载体中有的位点,尽量避免使用载体中相邻的位点,尽量避免使用平末端位点;所选位
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