个人载体构建心得.doc

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1、个人载体构建心得　　个人载体构建心得此文转自论坛，个人觉得体会很深，分享给大家！这两年在美帝净做克隆实验了，以前读PHD时候还觉得自己分子克隆挺牛X的，来这边之后做了各种各样的构建才知道以前是坐井观天，刚才粗粗统计了一下，在美帝一年零八个月，我构建的质粒超过四百个，其中有很简单从PCR构建到拿WB结果的一共不到一周，也有巨难的花了四个月时间换了几次strategy才弄好激动得我半夜給老板发信的品种；有单片段酶切插入这种不用脑型的，也有九个片段逐一插入正反向还不同的。　　专家不敢说，但是熟能生巧，确实积累了不少经验，现在系里从POSTDOC到PHD学生到TECH构

2、建前很多人都跟我商量（做博后结果成了技术员的人生真悲哀啊）。　　我老板甚至开玩笑说，我们将来开个公司，我专门负责构建（这话听得我想揍他大家同意不？）想了想还是把经验写下来，一来做个记录，二来博同行一笑，能让大家少绕点弯路则更好。　　1.准备工作俗话说用欲善其事，必先利其器。　　我强烈建议大家在做构建之前先找好工具，这样起的效果事半功倍。　　这里说个笑话，我们系有个新PHD学生，是个印度女孩，很聪明很刻苦，她所在的实验室也很好，不过除了她之外包括老板在内都是生物物理背景的，以前一个生物POSTDOC在的时候还好，这个POSTDOC一走，整个实验室对分生就只有一个粗

3、浅的概念，这个女孩就想把一个质粒上的基因插到另一个质粒上去，要是我就先查查有没有合适的酶切位点，要没有就改造一下质粒一切搞定，这女孩她不懂啊（要命的是她老板固然牛，对这方面也不懂），自己辛辛苦苦设计了PCR引物去做PCR，P了将近5K的产物去测序，结果测的结果中间有个MUTATION，要懂行的就找找酶切位点，从原来的替换上去，然后测下这段就行。　　她呢，又送去了若干了质粒一个接一个的测，一个测序反应这边是8刀，一个质粒测下来就是40刀，她光测序就要花好几百刀（你得佩服老美实验室真有钱呀）。　　这件事教育我们准备工作是多么重要！这里推荐大家两个工具，一个都知道，P

4、RIMER5.0。　　另一个工具极强大，也不知道国内流行不，叫lasergene，也就是DNAStar包括设计引物到构建图谱一应俱全，图谱非常漂亮，而且分析酶切位点等等就超NB，如果感兴趣的话我可以給大家传一个图谱看看。　　2.PCR如果没有现成的质粒可供酶切，PCR是最理想也是最方便的策略。　　关于PCR具体技术坛子内帖很多，我不多说了，这里仅在构建方面谈一谈。　　如何设计引物？首先，看懂质粒图谱！拿大家比较熟悉的PEGFP-C1和PEGFP-N1做例子。　　想用N1质粒，设计引物就得把下游引物上的中止密码子去掉，不要辛辛苦苦的一路做下来结果根本不表达融合蛋白

5、，你就死了；C1质粒，注意frame，要是移码了，你也死了。　　而且PEGFP系列有　　1、　　2、3，要弄清楚别弄窜了。　　一句话，要看懂你的图谱！再多一句，PEGFP的XBA1和Bcl1位点不能用。　　注意在设计酶切位点的时候要加保护碱基（大家要用T载体就当我没说）。　　酶切位点设计也有一定的讲究，我的原则是，能用粘端就用粘端，实在不能用的就用只好用一些常用的平端酶，如ECORV和SNAB1之类，要是以后还有别的用处就多加点酶切位点，我曾一口气在引物上加了五个酶切位点以防以后要用到，注意计算TM的时候要减去这些不match的序列，或者选用touch-up策略

6、。　　除了酶切位点，还要注意KOZAK序列的问题，很多质粒没有提供KOZAK序列，这要在设计的时候直接在引物上加好。　　GENEOVERLAP也比较有用，比方说加个FLAG片段，HIS片段，2A序列之类的，直接设计三引物OVERLAP一下就可以，省得还要再多构建一步，这些都是设计引物时候就要考虑好的。　　引物长一点不要紧（我最喜欢两步法了），尤其是对GC比高的序列，有时候引物不长PCR根本不出结果，注意如果GC比较高，这个时候GENEOVERLAP就不要做了，很麻烦，克隆很难挑。　　没有合适的酶切位点？很简单，用同尾酶策略，比方说Bgl2和BamH1，Nhe1和

7、spe1，Xho1和Sal1（注意连上了切不下来），实在不行就平端吧，只要不超过4KB，平端酶连接也不那么难。　　如何选择Taq酶？选择Taq酶也很关键，首先，高保真（Highfidelity）这是必须的，我在国内常用LAKIT，可这边***忑贵，只好用（美）国货。　　常用的PFU，PHUSION和PFX。　　PFX50是invitrogen公司的，一度曾卖到脱销，保真性应该是目前最高的，是普通Taq的50倍，对一般基因绝无问题（我同事4.5KPCR产物，居然一个突变都没有），但是对比较难PCR的高GC或者位点比较难做PCR的基因（基因组为模板）就明显不行了；P

8、FU(安捷伦)保真性没有