构建载体-个人总结(o.o)

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1、构建载体（一）流程图示根据目标片段设计扩增引物（片段大于1kb时，同时设计测序引物）PCR扩增目标片段抽质粒载体（扩增外源DNA片段）→检测DNA的质量（琼脂糖凝胶电泳/吸光度）→酶切载体与外源DNA→载体的去磷酸化→连接载体与外源DNA→制备感受态细胞→连接子转化感受态细胞→重组子筛选及鉴定（PCR检测，酶切检测，测序检测）（二）具体步骤及相应原理A．质粒抽提1）原理细菌培养物的生长（从平板上挑取单菌落接种于含相应抗生素的培养基中，培养至对数生长后期即可）→细菌的收集（离心）及裂解（离子型或非

2、离子型去污剂、有机溶剂、碱处理或加热处理等方法，方法取决于质粒的大小、大肠杆菌菌株及裂解后纯化质粒的方法）→质粒DNA的分离和纯化（1）碱裂解法solutionI：重悬细菌solutionII：其中的SDS破坏细胞壁、膜，使细胞内容物释放出来，NaOH使DNA变性、碱基对打开，使宿主染色体DNA双链分开，而闭合环状的质粒DNA处于拓扑缠绕状态，两个环并不分开solutionIII：中和作用，宿主DNA由于很大，碱基还未来得及配就在冰冷的条件下与SDS、蛋白质、高分子量的RNA等缠绕在一起沉淀下来

3、，而质粒DNA由于很小且双链未分开，能够迅速配对重新形成超螺旋，处于溶解状态。SolutionI:Tris.HCl（pH7.5）50mMEDTA10mM螯合Mg2＋、Ca2＋等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用（DNase作用时需要一定的金属离子作辅基;EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境RNaseA100µg/ml建议：检查配送的RNAseA是否完全加入到BufferA1中，加入RNAseA后，BufferA1/RNAseA应该存放在4度

4、，如果存放时间过长，或者没有正确存放，请重新加入RNAseA；SolutionII:NaOH0.2M(促使染色体DNA与质粒DNA的变性)SDS1%(变性沉淀蛋白质,但SDS抑制核糖核酸酶，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，防止在下一步操作中（用RNase去除RNA时）受到干扰。)SolutionIII（Finalconcentration）:NaAc1.32MUsingHActoadjustpHto4.8NaAc的水溶液呈碱性(PH=4.8),必须加入大量的冰醋酸,所以该溶液实际上是N

5、aAc-HAc的缓冲液。用pH4.8的NaAc溶液是为了把pH12.6的抽提液，调回pH至中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。而高盐的3mol／LNaAc有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀之。前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，后者是因为钠盐与SDS－蛋白复合物作用后，能形成较小的钠盐形式复合物，使沉淀更完全。TE(pH8.0)Tris.HCl（pH8.0）10mMEDTA（pH8.0）1mM（2）试验中用到的抗生素和酶氨苄青霉素（a

6、mpicillin）：其主要是通过抑制细胞壁的合成杀死正在生长的大肠杆菌。氨苄青霉素抗性基因（ampr）：合成β-内酰胺酶，在氨苄青霉素进入细胞之前将其水解(使用浓度100µg/ml)；卡那霉素（Kanamycinsulfate）：核糖体结合抑制蛋白质的合成（使用浓度：50µg/ml)；RNaseA:C或U的3’－P与相邻的5’－OH处切开。配制：一般以10mg/ml溶于TE中，然后在沸水中煮15分钟，分装成小份储存于－20℃。Note：在具体配置抗性LB时候，一般按照千分之一的比例加入，即35

7、0mlLB中加入350ul抗性溶液（于-20℃保存）；2）具体步骤一般地，先打电转获得含有相应载体的大肠杆菌菌液：1.取含有相应载体的大肠杆菌菌液于含有相应抗生素的LA培养基上涂布或划线分离单菌落（37℃过夜培养）；2.用枪头or无菌牙签挑取单菌落，接种于含有相应抗生素的LB培养基中，（250r/min，37℃摇床过夜培养）；(在具体的操作过程中，直接刮取质粒)3.吸取1.5ml菌液，12000g离心1分钟，收集菌体，倒掉菌液；吸取1.5ml菌液，再次收集菌体，尽量将菌液倒干净（尽量使用2ml离

8、心管）；4.加入300ml溶液I振荡打匀，重新悬浮细胞，震荡混匀（注意：应彻底打匀沉淀或碎块），可以使用牙签便于震荡，但菌体较少时不要使用；5.加入300ml溶液II，轻柔颠倒混匀，放置至清亮，一般不超过5分钟；6.加入300ml溶液III，颠倒混匀，放于冰上10分钟（-20℃），使杂质充分沉淀；7.12000g离心10分钟；8.吸取800ml上清液（注意：不要吸取到飘浮的杂质）至另一离心管中，加入2/3体积的异丙醇，-20℃保存过夜；9.12000g常温离心15分钟；10.倒尽上清，加75％乙