美花石斛种质资源的RAPD分子鉴定.doc

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1、美花石斛种质资源的RAPD分子鉴定作者：包英华白音王文全阎玉凝【摘要】冃的采用RAPD分子标记技术对不同产地美花石斛进行分析，为美花石斛种质资源的准确鉴别提供依据。方法用RAPD分子标记技术对不同产地美花石斛基因组总DNA进行PCR扩增，根据其扩增产物分子量大小进行编码计算。结果从117种随机引物筛选出8种有效引物，S2108的PCR扩增产物中的特异性位点能够鉴别出广西玉林居群和贵州安居群。结论利用RAPD分子标记技术鉴别美花石斛种质资源是可行的，在严格控制各项条件下能够保证鉴别美花石斛种质资源的稳定性和重复性。【关键词】美花石斛；种质资源；RAPD；分子鉴

2、定Abstract:ObjectiveToauthenticatethegermplasmresourcesofDendrobiumloddigcsiicollectedfromdiffcrcntareasbyRAPD・MethodsThetotalDNAofD・loddigesiiwasamplifiedbyRAPD-PCR,andtheamplifiedDNAwereinvestigatedbasedontheirmolecularweightandamplifyingdistances・Results8effectiveprimerswereselec

3、tedfrom117randomprimers・SomepolymormiclociamplifiedfromprimerS2108couldeffectivelyidentifyYulinpopulationandAnlongpopulationofD.loddigesii.ConclusionItisfeasibleforidentifyinggermplasmresourcesofDendrobiumloddigesiiusingRAPDmolecularmarker,andthestabilityandrepeatabilityofidentific

4、ationresultscanbeinsuredunderthestrictandnormativeexperimentprocessesinRAPD・Keywords：Dendrobiumloddigesii；Germplasmresources；RAPD；Molecularauthentication美花石斛DendrobiumloddigesiiRolfe为兰科石斛属多年生草本植物，别名为环草石斛、粉花石斛或耳环石斛等。美花石斛主要分布于贵州、广西、云南和广东等地区，是我国常用名贵中药材，具有滋阴清热、益胃生津和润肺止咳等功效，主要含有多糖、生物碱和S

5、tiIbenoids类等化学成分［1〜3］。由于美花石斛种子在自然条件下萌发率极低，再加上长期过度采收，导致野生美花石斛种质资源急剧减少，甚至难以找到较为完整的野生居群。于1987年出台的《国家重点保护野生药材物种名录》屮，美花石斛（环草石斛）被列入国家三级珍稀濒危保护植物。自从2004年以来，课题组成员对云南、贵州、广西和广东等省区的美花石斛种质资源进行多次考察，发现不同产地美花右斛形态特征具有一定的差异，然而这些外部形态特征受环境因素的影响较大，容易产生变异，因此仅仅依靠外观特征，很难准确鉴别出其原植物。随着分子生物学的快速发展，生物技术和方法不断得到完

6、善，同时也促进了相关学科的发展步伐。如DNA分子标记技术和方法广泛应用于中药材鉴定领域，取得了许多令人可喜的成绩。RAPD（RandomAmplifiedPolymorphicDNA）是1990年由J.G.Williams等［4］和J.Welsh等［5］推出的一种分子标记技术，是以PCR反应为基础，以随机碱基寡核昔酸为引物，对基因组DNA进行扩增而显示出多态性的DNA指纹技术。因其操作简便、反应迅速、成本低和DNA用量少等优点而被广泛应用于多种中药材的鉴别上，但美花石斛种质资源的RAPD分子鉴别方面的研究报道尚未见到。本文利用RAPD分子标记技术对不同产地美

7、花石斛种质资源进行分析，为美花石斛种质资源的准确鉴别提供理论依据。1材料与方法1.1材料实验材料采自贵州、云南和广西等地区的野生美花石斛（表1）,由北京中医药大学阎玉凝教授鉴定。取幼嫩叶片8〜10片，用变色硅胶干燥，存放于-70°CSIM型超低温冰箱（美国西蒙公司），备用。表1用于RAPD分析的不同居群美花石斛样品（略）1.2基因组DNA的提取和检测采用改进的4XCTAB法，制备模板DNA。称取低温保存的不同居群美花石斛叶片0.20g,研磨后放入5ml离心管中，加1ml4XCTAB溶液，混匀，4°C8000r/min离心5min,弃上清液。在沉淀中加65°C

8、预热的1.5ml4XCTAB溶液，65°C水浴30m