美花石斛种质资源的rapd分子鉴定

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1、美花石斛种质资源的RAPD分子鉴定作者：包英华白音王文全阎玉凝【摘要】目的采用RAPD分子标记技术对不同产地美花石斛进行分析，为美花石斛种质资源的准确鉴别提供依据。方法用RAPD分子标记技术对不同产地美花石斛基因组总DNA进行PCR扩增，根据其扩增产物分子量大小进行编码计算。结果从117种随机引物筛选出8种有效引物，S2108的PCR扩增产物中的特异性位点能够鉴别出广西玉林居群和贵州安居群。结论利用RAPD分子标记技术鉴别美花石斛种质资源是可行的，在严格控制各项条件下能够保证鉴别美花石斛种质资源的稳定性和重复性。【关键

2、词】美花石斛；种质资源；RAPD；分子鉴定　　Abstract：ObjectiveToauthenticatethegermplasmresourcesofDendrobiumloddigesiicollectedfromdifferentareasbyRAPD.MethodsThetotalDNAofD.loddigesiiplifiedbyRAPD-PCR,andtheamplifiedDNAolecularplifyingdistances.Results8effectiveprimers117randompri

3、mers.SomepolymormiclociamplifiedfromprimerS2108couldeffectivelyidentifyYulinpopulationandAnlongpopulationofD.loddigesii.ConclusionItisfeasibleforidentifyinggermplasmresourcesofDendrobiumloddigesiiusingRAPDmolecularmarker,andthestabilityandrepeatabilityofidentifi

4、cationresultscanbeinsuredunderthestrictandnormativeexperimentprocessesinRAPD.　　Keyloddigesii；Germplasmresources；RAPD；Molecularauthentication美花石斛DendrobiumloddigesiiRolfe为兰科石斛属多年生草本植物，别名为环草石斛、粉花石斛或耳环石斛等。美花石斛主要分布于贵州、广西、云南和广东等地区，是我国常用名贵中药材，具有滋阴清热、益胃生津和润肺止咳等功效，主要含有多

5、糖、生物碱和Stilbenoids类等化学成分［1～3］。由于美花石斛种子在自然条件下萌发率极低，再加上长期过度采收，导致野生美花石斛种质资源急剧减少，甚至难以找到较为完整的野生居群。于1987年出台的《国家重点保护野生药材物种名录》中，美花石斛(环草石斛)被列入国家三级珍稀濒危保护植物。自从2004年以来，课题组成员对云南、贵州、广西和广东等省区的美花石斛种质资源进行多次考察，发现不同产地美花石斛形态特征具有一定的差异，然而这些外部形态特征受环境因素的影响较大，容易产生变异，因此仅仅依靠外观特征，很难准确鉴别出其原植

6、物。随着分子生物学的快速发展，生物技术和方法不断得到完善，同时也促进了相关学科的发展步伐。如DNA分子标记技术和方法广泛应用于中药材鉴定领域，取得了许多令人可喜的成绩。RAPD(RandomAmplifiedPolymorphicDNA)是1990年由J.G.型超低温冰箱(美国西蒙公司)，备用。表1用于RAPD分析的不同居群美花石斛样品（略）　　1.2基因组DNA的提取和检测　　采用改进的4×CTAB法，制备模板DNA。称取低温保存的不同居群美花石斛叶片0.20g，研磨后放入5ml离心管中，加1ml4×CTAB溶液，混

7、匀，4℃8000r/min离心5min，弃上清液。在沉淀中加65℃预热的1.5ml4×CTAB溶液，65℃水浴30min，加等体积的氯仿：异戊醇(24∶1)，混匀5min，4℃5000r/min离心5min，吸取上清液，加无水乙醇，4℃10000r/min离心10min，沉淀用70%乙醇清洗，干燥，用0.1×TE溶解,4℃保存。精密吸取20μl基因组DNA溶液，稀释至2ml，用Ultrospc2000紫外/可见分光光度计，测定紫外吸光度，计算其浓度和纯度。检测结果显示，DNA浓度和纯度分别为50ng·μl-1和1.7～

8、1.9，符合PCR扩增要求。　　1.3引物筛选实验所用引物共117条(购自上海生工，S80～200，S1001～1020，S1341～S1360和S2101～2160)。以贵州兴义居群为模板，对引物进行筛选，获得50个具有扩增条带的引物，在此基础上，进一步筛选出扩增条带多而清晰的8种引物，用于分析美花石斛种质资源的RAPD分析。