美花石斛rapd

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1、美花石斛RAPD白音，包英华，王文全,阙生全，谭庆辉【关键词】美花石斛；,,基因组DNA；,,RAPD-PCR反应体系摘要：目的建立美花石斛基因组DNA的RAPD-PCR最佳反应体系。方法在提取纯化美花石斛基因组DNA的基础上，利用PCR扩增技术和方法，对Mg2+，dNTP，模板DNA.freelmolL-1，Taq聚合酶1.2U，引物浓度0.3mmolL-1，模板DNA46ng和dNTPs160mmolL-1；PCR扩增程序为94℃预变性3min，94℃变性50s，40℃退火1min，72℃延伸2min，循环40次，72℃延伸5min。结

2、论该反应体系具有经济，简便以及扩增条带较清晰而稳定等特点。关键词：美花石斛；基因组DNA；RAPD-PCR反应体系Abstract:ObjectiveToestablishthebestreactionconditionofRAPD-PCRamplificationsystemofDendrobiumloddigesii.MethodsSomereactionconditionizedbyamplifyingtechnologyandmethodofPCRbasedonisolatinggenomicDNAfromD.loddigesii.

3、ResultsThebestamplificationsystemforD.loddigesiie25μl,including1.2mmolL-1Mg2+，1.2uniteTaqpolymerase,0.3mmolL-1randomprimer,46ngtemplateDNAand160mmolL-1dNTPs;theamplificationprocedureconditionsinfolloin,extensionat72℃for2min,cycling40times,lastextensionat72℃for5min.ThePCRam

4、plificationbandsforfiveindividualsofthisspeciesplificationsystem.ConclusionThisamplificationsystemisveryeconomical,.freelloddigesii;GenomicDNA;RAPD-PCRamplificationsystem美花石斛DendrobiumloddigesiiRolfe为兰科（Orchidaceae）石斛属多年生草本植物，又称环草石斛、粉花石斛或耳环石斛等，主要分布于贵州、广西、云南和广东等少数几个省区。美花石斛是

5、我国常用名贵中药材，具有滋阴清热、生津益胃和润肺止咳等功效，含有多糖、生物碱和Stilbenoids类等化学成分［1~3］。由于在自然环境中，美花石斛的种子萌发率很低，再加上长期过度采收，导致野生美花石斛种质资源急剧减少，甚至难以找到较为完整的野生居群。于1987年出台的《中国珍稀濒危保护植物名录》中，美花石斛（环草石斛）被列为国家三级珍稀濒危保护植物之一。自200503~04，课题组成员奔赴云南、贵州、广西和广东等省区，考察美花石斛种质资源时发现不同产地的美花石斛种内具有丰富的遗传变异。然而，目前尚未见到有关美花石斛种内遗传变异方面的研究

6、报道。RAPD（RandomAmplifiedPolymorphicDNA）是1990年由J.G.g2+，dNTP，模板DNA，引物，Taq聚合酶等反应参数要求十分严格。只有通过优化试验来建立最佳反应体系，才能获得较为稳定而重复性的实验结果。本文对美花石斛RAPD-PCR反应体系中的Mg2+浓度，dNTP浓度，模板DNA浓度，引物浓度，Taq聚合酶量以及复性温度和反应次数进行优化，建立一个较为稳定而可靠的反应体系，为探索美花石斛遗传多样性分析奠定基础。1器材1.1材料实验材料采自于贵州省兴义市则戎乡野生美花石斛Dendrobiumloddi

7、gesiiRolfe，由北京中医药大学阎玉凝教授鉴定。共选择5个个体，取同一个个体的幼嫩叶片5～6个，现场用变色硅胶及时干燥，回到实验室后，及时清洗，并存放于-70℃超低温冰箱，备用。1.2药品仪器CTAB，Tris，EDTA，PVP(K30)（北京鼎国）；10×Taq酶配套缓冲液，dNTP，MgCl2，Taq酶和琼脂糖（广州威佳）；引物、B-巯基乙醇和1MTE（上海生工）等。DYY-2C三恒多用电泳仪和DYCP-31D琼脂糖水平电泳槽(北京六一仪器厂)；TGL-16G高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)；金燕HH-S28S数显恒温水浴锅（

8、金坛市大地自动化仪器厂）；Super-PCR基因扩增仪(日本株式会社フヱロ-テック)；超低温冰箱(SIM美国西蒙公司)；ImageMasterVDS凝胶成像系统（瑞士Ameish