表皮生长因子ELISA检测方法的建立.pdf

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1、表皮生长园子酶联免疫吸附试验检测方法的建立罄墨掣乏絮鉴糕霪羹鋈囊霾霾塑鬟黧鏊ELISA羹鋈羹羹鬻囊嚣爨囊测慰西觏；巍掣髫ELISA!}直l矧鎏赢二墨笺EGF嚣职囊《撼静＆黪嗡兹；嚣裾弱嚣越臻舾期rhEGF磐妻蠹蓠习裂蕊若巍矮密，裂巍戮莪豢嚣羔懿ELISA(曩浸嚣珏ELISA；一嗝一籀镉镭瓣ELISA)爱独EGF，霖墨蔫帑糕蕊滔堵磊璀堪溻遑再美丽羁l／LH2sOt(注：鼠IsA溶液静酝翻觅筵二帮分)2．2方法2．2．1抗rhEGF多克隆抗体的制备1)戳rh黼F鞭白为抗原，取成年雄性新西兰大白兔4只，在辩其进行撼础免疫前采墩斑清备用，睫聪进行免疫。2)2．5m1无菌双蒸水溶解1mg

2、EGF，然后与2．5ml的完众佛氏後剂充分混合成掣I状物3)第一次免痰：1m1／熙兔子，每个前肢注射0．5ml兔爨碘溪潺毒被注瓣簿霞{l蓼菠，曩l娃瀵毒懿注射嚣旋下注冀重，壹裂鼓起一乳白色小包。继续喂养，一个月厝第二次免疫。4)第二次免疫：l燕l／袋兔子，每个爱簸注瓣0。s瑶l，方法露第一次免疫，～个星期詹试血。2．2。2藏斑清静收集帮分离将大囱咔寰彩占꾰锓掷将大囱兔仰卧嗣定，心脏穿刺点刮毛，消毒皮肤，50ml灭菌注射嚣进行心"x表皮生长圈子酶联免疫暇附试验检测方法的建立及韧步临珠应用3)阻断反应：采用根外阻断模式：将一定浓度32，16，8。4，2，1，0．5，0，25ng／m

3、lrhEGF50#i／魏，1：10万耩释度弱rhEGF撬盘瀵50#1／魏攘灭酶橼叛，加入没宵包被rhEGF但已用封闭液封闭的W靛板i0攀圜滩清罐!：374C；抗皿§≤；杂匿虢嚣j委f搿潲毽强灞灞摅原抗体结合率睫麓下降。Fig．2—2：standardcurveofthemeasure瞻entofrhEGF一·一赡E弹浓发2．3．2对rhEGF抗血清纯度和特异性的检测抗rhF抗血清纯度和特异性的检测抗rhEGF多抗血清缀饱和硫酸铵分级沉淀法纯化后，A。nm和A。。哪光吸收"x表皮生长瓣予酶载免疰暖辩试验硷测方法酶建立及裙步牾寐应麓(1)批内误差：每～标准样品浓度作4次熏复，以其批

4、内变异系数表示批内误麓。(2)批间误差：重复步骤7操作，连续3次，以其批闻变异系数表示批间误差。3．2．2单抗一多抗夹心ELISA基本程序3．2．2．1标准品和质控样鼎的制备冻干的重组hEGF购囱深圳华生元基因工糨有限公司，用抗原稀释液溶解并醚铡成浓度为0．8mg／ml的标准赡存液，小鬃分装存于一80"C备用。标准晶在检溅蠹蓼瓣撬藤耩释滚凝鲜鬣麓，储存蠢准晶最终怒镬浓度旁125，250，500，1000，2000，4000和8000pg／ml。质控品由标准储存液通过抗原稀释液稀释为4000pg／ml，检测时用抗原稀释液稀释为250，1000和4000pg／ml的浓度。质控品和标

5、准品均存于一80℃。3．2。2，2包疆撬体及揍纛瀵王终浓度鳃选撵采羽摸盘滴定法，识被荦抗采用lOug／ml，5ug／ml，2。sug／ml3个浓度；多抗漾用40，20，i0，5ug／ml4个浓度；rhEGF采用0，25～8ng／ml系列倍比稀释。酶标=抗的工作浓度为1：8000。3．2．2。3夹心法的ELISA蒎本操作过程1)酝被：戳0。05M，pH9．5辩‰e逸一NaHCO。缓狰滚壤5#g／ml魏rhEGF包较酶耩投，i00Hi／孔，4"C，澄盒内包被过夜。2)封闭；用0．05％Tween-20的PBS(PBST)洗涤3次，拍干后加i5％小牛血清的PBS封闭，300ul／孔，

6、37℃，lh，然后用PBST洗涤3次。3)按上述浓度秘入i00#l／孑L标准晶，矮羧鼹及待捡测群品，麓佟复琵。酶标羧巍霆温瓣弯2hr露矮0。05％Tween-20豹PBS(P酷{)洗涤3次弗撼予。4)以棋盘滴定选定的多抗浓度在每个酶标张中加入i00p1多抗，酶标板在室温孵宵lhr后用0．05％Tween一20的PBS(PBST)洗涤3次并拍干。5)加酶标二抗：PBST洗涤3次后加l：8000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，100驻I／魏，璧澈孵毒强。6)PBST洗涤4次后，加酝剖的底物液TMB和H202各的ul／孔，37℃15min。7)终止反应：加入2MH。S04，5

7、0ul／孔。表皮生长因子酶联免疫I簸附试验检测方法的建立及初步临床成用8)测On。。：置MK2酶标仪测定450nm波长的OD值。3，2。2。《绫整范鋈以rhEGF浓度对450nm吸光魔德绘图，绘制标准曲线。通过标准曲线求质控及待测样品的浓度。3。2．2．5矮控品检测戆精密度器缕确发评徐准备3个标准储存液及1个4000pg／ml的质控样品。每天针对1个标准储存液(稀释后获7个标准值)作标准曲线，每次作两个标准曲线。作每一标准曲线均俸3令滚廑豹矮羧襻晶，每一浓麟祥鑫缘痒复魏。连续3天霹褥6条标准