血站核酸检测完整版本.ppt

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1、血站核酸检测甘肃省红十字血液中心血站核酸检测的意义核酸检测（NAT）可以有效地缩短病毒特异抗原和抗体免疫测定的“窗口期”，从而减少输血风险，提高输血安全。乙型肝炎病毒（HBV）感染检测中，NAT除可缩短HBV感染检测的窗口期外，还可以减少HBV急性感染恢复期、慢性隐匿性HBV感染以及变异病毒株感染的漏检。丙型肝炎病毒（HCV）感染检测中，可将HCV感染检测的窗口期缩短，减少免疫静默感染的漏检。人类免疫缺陷病毒（HIV）感染检测中，可将HIV感染检测的窗口期缩短。检测窗口期WindowPeriod核酸研究的历史1869米舍尔（FriedrichMiescher）从脓球分离出细胞核，不受蛋白酶分

2、解，磷含量高，命名为“核素”(nuclein)。1944美国微生物学家埃弗里（O.T.Avery）等的肺炎球菌转化实验。1953沃森和克里克（WATSON，CRICK）-DNA双螺旋FrancisCrick核酸研究的历史1960年代中期桑格(Sanger)的DNA测序法1972伯格(PaulBerg)–重组DNA技术引起人肿瘤的猴病毒基因与噬菌体lambda的重组1973博耶（HerbertBoyer）和科恩（StanleyCohen）-使用重组DNA技术首次得到了重组DNA微生物(基因工程技术)1983穆利斯（KaryMullis)–PCR技术核酸的种类DEOXYRIBONUCLEICAC

3、ID（DNA）RIBONUCLEICACID（RNA）——ribosomeRNA(rRNA)transferRNA(tRNA)messengerRNA(mRNA)核酸的分子组成元素组成CHONP（恒定，9~10%）基本结构单位——核苷酸磷酸核苷（戊糖、碱基）核酸的理化性质核酸分子具有强烈的紫外吸收DNA变性是双链解离为单链的过程DNA的增色效应Tm值变性的核酸可以复性或形成杂交双链复性退火核酸分子复性和杂交示意图磁珠提取的原理：第一步：细胞的裂解：破碎细胞，并向溶液中加入磁珠第二步：结合核酸：pH较低，在高盐环境下，硅胶磁珠带正电荷，选择性的与优化试剂中的核酸结合第三步：洗涤：用洗涤液将

4、非核酸成分冲洗分离（为清洗干净该步骤可以重复多次）第四步：核酸的洗脱：pH升高，在低盐环境下，核酸被洗脱下来核酸检测基本原理核酸检测：一系列直接检测病原体核酸的技术的总称，对靶核酸直接扩增或对其附带的信号扩增，使看不见的极微量的核酸变成直观的光电或可视信号。NAT检测技术方法PCR扩增技术转录介导的扩增方法（TMA、NASBA）其它NAT技术（bDNA、LAMP、LCR、SDA等）PCR原理DNADNATMA的原理Transcription-MediatedAmplification转录介导的扩增技术模拟DNA转录成mRNA的自然过程DNA模板在反应中作为中介利用2个引物和2种酶(RNA聚合

5、酶和逆转录酶）RNA聚合酶与DNA模板的启动子序列结合等温扩增（41.5℃）转录翻译逆转录TMA的原理特异性靶标捕获特异性捕获探针与病毒核酸分子及内标物杂交结合，并将其固定在磁珠表面。对体系进行重复的洗涤，去除血液样品中除病毒核酸外的其他成分。转录介导的扩增借助逆转录酶和RNA多聚酶的共同作用，在等温条件下，经过一小时的扩增得到约10亿个目标产物片断。双动力学化学发光检测试剂消除未结合的检测探针，双动力学化学发光检测，分别检测内标与病毒分子信号。理想的核酸扩增实验室设计A理想的核酸扩增实验室设计B核酸扩增检测实验室设计的一般原则各区独立注意风向因地制宜方便工作关于“区域”合并如使用

6、扩增和产物分析同时完成的实时荧光PCR仪进行核酸扩增检测，扩增区和产物分析区可以合并。如使用核酸提取、扩增及产物分析等均在一台仪器上完成的全自动核酸检测分析仪，标本制备区、扩增区和产物分析区可合并。符合基本要求的核酸扩增检测实验室的条件（1）试剂准备区、标本制备区和扩增及产物分析区等三个或四个区域在物理空间上，必须是完全相互独立的，各区域无论是在空间还是在使用中，应始终处于完全的分隔状态，不能有空气的直接相通。（2）各区的可移动的仪器设备及各种物品包括实验记录本、记号笔、试管架及清洁用具等必须专用。（3）应在标本制备区、扩增及产物分析区等相对有可能出现“污染物”的区域安装排风扇或其它排

7、风和有效的装置，以使空气按试剂准备区标本制备区扩增（及产物分析）区方向流动。核酸扩增实验室的工作流程试剂准备区标本制备区扩增区及扩增产物分析区试剂贮存准备区核酸扩增实验室中最为“洁净”的区域，不应有任何核酸的存在，包括试剂中所带的标准品和阳性对照。所有实验用洁净物品如离心管、吸头等的存放和准备处。商品试剂盒自制试剂：一次较大量配制，然后分装成小瓶保存，每次检测时，取出一小瓶使用，未用完的即弃掉，不再