超高效液相色谱串联质谱法检测食品中蜡样芽孢杆菌呕吐毒素Cereulide.pdf

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1、第4O卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第8期2012年8月ChineseJournalofAnalyticalChemistryl267～1273超高效液相色谱串联质谱法检测食品中蜡样芽孢杆菌呕吐毒素Cereulide张秀尧蔡欣欣李毅(温州市疾病预防控制中心，温州325001)摘要建立了快速检测食品中蜡样芽孢杆菌呕吐毒素Cereulide的超高效液相色谱三重四极杆质谱联用分析方法。样品提取液经硅胶和Carb固相萃取柱净化后，以0．1％甲酸一0．2mmol／L乙酸铵溶液和0．1％甲酸一乙腈溶液作为流动相进行梯度洗脱，在Acq

2、uityBEH300C。柱上实现分离，正离子ESIMS／MSMRM方式检测，以”cCereulide作为内标的稳定同位素稀释法进行定量分析。一次进样分析时间为7rain。米饭、添加33％玉米胚油的米饭和婴儿配方奶粉中平均加标回收率分别为85．7％～87．5％，85_3％～110％和94．2％～113％；相对标准偏差为4．6％～13％，5．9％～9．1％和3A％～6．5％(一6)；定量限为10ng／kg(S／N=10)。方法灵敏、准确，适合于食品样品中Cereulide的测定，并已成功应用于食物中毒样品的检测。关键词超高效液相色谱串联质

3、谱；蜡样芽孢杆菌；呕吐毒素；食品1引言蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)是常见的食品污染菌，能导致呕吐型和腹泻型的食物中毒。呕吐型食物中毒是由蜡样芽孢杆菌的一些菌株产生的呕吐毒素(Emetictoxin)引起的，呕吐毒素的主要成分为Cereulidet1]。Cereulide为十二环肽，引起臭胸鼠(Suncusmurinus)呕吐的半数有效剂量(ED50)口服为12．9ktg／kg体重，静脉注射为9．8~tg／kg体重，它具有空泡结构，能与存在于肠胃道周围神经系统中的5-羟色胺受体结合，刺激迷走神经的传输，从而引起急性中毒闭

4、。它对细胞还有损伤作用，尤其是对人的肝脏细胞，其肝毒性可致人死亡。它还能抑制人的自然杀伤细胞，从而影响免疫力[41。由于Cereulide与另一种细菌毒素缬氨霉素(Valinomycin)有相似的化学结构和特性(图1)，均可引起HEp一2细胞线粒体肿胀。K是这两种细菌毒素的载体离子，Cereulide对K的亲和性更强，决定了其毒性比缬氨霉素更强1。Cereulide不溶于水，脂溶性大，-耐热、耐蛋白酶水解，对酸、碱稳定(pH2～11)；高温121℃持续30min不失活；一般的食品加工过程不被破坏，甚至胃酸和肠管中的蛋白酶也不能分解破坏

5、；在活菌被消除的情况下仍能引起食源性疾病，传统的微生物培养分析方法无效，需要直接测定标本中Cereu—lide的含量，这是食物中毒诊断的最直接证据。因此，对于食物中毒，即使检测不出活菌，如果未进行Cereulide检测，也不能排除蜡样芽孢杆菌为致病源。被Cereulide污染的食品不发生腐败变质，也无异昧，是食品安全不易发觉的隐患。随着即食型食品大量进入市场，这种隐患越来越突出[81。周帼萍等分析了198642007年我国299起蜡样芽孢杆菌食物中毒案例，结果显示，我国蜡样芽孢杆菌食物中毒以呕吐型为主(占75．9％)。在引发呕吐型食物

6、中毒的食品中，粮食加工品占有非常高的比例(69．6％)。呕吐型食物中毒的潜伏期很短，一般在0．5～6h，由于Cereulide的检测方法还不成熟，人的中毒剂量尚不清楚。因此，建立食品中痕量Cereulide的准确定量检测方法显得非常必要。目前，检测Cereulide的检测方法主要有：(1)动物试验法：属半定性的方法，不够准确，而且费用昂贵叫；(2)生物检测法：有细胞空泡应答检验法和体外精子活力试验法，只能进行半定量检测，并且一般的实验室很难进行；(3)PCR法[13,14]：测定的是产毒基因，而非毒素；(4)化学检测法：主要有液相色谱

7、一质谱联用方法，使用nano-HPLC-ESI-QTOF-MS法研究Cereulide及同系物的化学结构[15】；液相色谱离子阱质谱法用于蜡样芽孢杆菌产毒株在不同生长和培养条件下Cereulide生成量的测量，检出限为l0g／L11,16]；2011—1卜17收稿；20120319接受*E-mail：xyzwz123@126com分析化学第4O卷CereulideValinomycin图1Cereulide和Valinomycin的化学结构Fig．1StructuresofCereulideandvalinomycin液相色谱单四极杆

8、质谱SIM模式下测定干无花果中Cereulide，检出限可达1I．tg／kg[”】。最近，Bauer等报道了稳定同位素稀释法测定米饭、加油米饭、牛奶布丁和肝香肠中Cereulide，定量限为30～50~tg／kg[】。毛