胶体金免疫层析法快速检测牛奶、奶粉、饲料中的三聚氰胺.pdf

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1、第41卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第7期2013年7月ChineseJournalofAnalyticalChemistry1025～l030DOI：10．3724／SP．J．1096．2013．20972胶体金免疫层析法快速检测牛奶、奶粉、饲料中的三聚氰胺李淑群曹碧云常化仿邓安平(苏州大学材料与化学化工学部，苏州215123)摘要建立了快速检测牛奶、奶粉、饲料样品中三聚氰胺的胶体金免疫层析分析法。将三聚氰胺进行分子修饰得到两种衍生物，分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)相连制得免疫原和包被抗原。运用杂交瘤抗体制备技术得到

2、抗三聚氰胺的单克隆抗体(mAb)。利用柠檬酸三钠还原法制得平均粒径18nm的胶体金，将胶体金与抗三聚氰胺单克隆抗体相连，所形成的金标抗体(Au·mAb)包被在胶体金垫上，包被抗原和羊抗鼠二抗分别包被在硝酸纤维素膜(NC)上作为检测线(T线)和质控线(C线)。将胶金垫、NC膜、样品垫和吸水纸组装成免疫层析快速检测试剂条。将标准溶液(或待测液)滴加到样品垫上，10rain后可在NC膜C线和T线位置上用肉眼观察到胶体金的颜色(红色)，通过比对颜色的深浅判断样品中三聚氰胺的含量。结果表明，三聚氰胺的检出限为1OL；选用了其它10种物质对免疫层析试剂条进行了特异

3、性实验，免疫层析试剂条与2一氯4，6一二氨基一1，3，5-三嗪和环丙氨嗪的交叉反应率约为1％，与其它8种物质没有交叉反应；力口标样品用免疫层析试剂条和酶联免疫吸附分析法(ELISA)同时检查，结果一致。本方法适用于牛奶、奶粉、饲料样品中三聚氰胺的现场快速检测。关键词三聚氰胺；单克隆抗体；胶体金；免疫层析法1引言三聚氰胺(Melamine，图1a)，化学名为2，4，6-三氨基．1，3，5．三嗪，是一种重要的氮杂环有机化工原料，主要用作生产三聚氰胺甲醛树脂的原料，这种树脂被广泛运用于木材、塑料、造纸、纺织、皮革等行业；三聚氰胺还可以作阻燃剂、减水剂、甲醛清

4、洁剂等⋯。由于三聚氰胺分子中含有大量氮元素，而常规的“凯氏定氮法”检测食品或饲料中蛋白质含量时不能排除这类“伪蛋白氮”的干扰，因而一些不法分子为降低成本，在牛奶、奶粉和饲料添加这种非食品性化工原料，以提高其产品中的蛋白质含量。2008年lO月，我国制定了乳品中三聚氰胺管理限量值，婴幼儿配方乳粉中三聚氰胺的限量值为1mg／kg；含乳15％以上的其它食品中三聚氰胺的限量值为2．5mg／kg。目前，检测三聚氰胺的主要方法有气相色谱一质谱联用法(GC—MS)[2,3J、高效液相色谱法(HPLC)E4-6]、液相色谱．质谱联用法(LC—MS)E7J，这些方法虽然

5、准确度高，但样品预处理复杂、设备昂贵，检测费用高。近年来，酶联免疫吸附法以及胶体免疫层析试剂条¨H等已用于三聚氰胺的检测，但仍存在灵敏度不够高或特异性不够强等不足。本研究对三聚氰胺的分子结构进行了较合理的修饰，合成了两种三聚氰胺衍生物，并分别与牛血清白蛋白和鸡卵清白蛋白相连制得免疫原和包被抗原。利用杂交瘤抗体制备技术得到抗三聚氰胺的单克隆抗体，以所制得的抗体为基础，建立了测定牛奶、奶粉、饲料中三聚氰胺的胶体金免疫层析法。2实验部分2．1仪器与试剂UV．2300型紫外。可见分光光度计(上海天美科学仪器有限公司)；Dura12FV纯水机(美国THELAB公

6、司)；SunriseRemote酶标仪和M12／2R洗板机(奥地利Teean公司)；硝酸纤维素膜(Whatman公司)，底板，吸水纸，玻璃纤维素膜(上海杰一生物有限公司)；三聚氰胺(成都长征化学试剂有限公司)；2012-09-26收稿；2013-01—22接受本文系国家自然科学基金(No．21175097)资助E-mail：denganping@suda．edu．ca分析化学第41卷柠檬酸三钠，氯金酸，二甲亚砜(上海国药有限公司)；牛血清白蛋白(Bovineserumalbumin，BSA)、鸡卵清白蛋白(Ovalbumin，OVA)、酪蛋白、3，3，

7、5，5．四甲基联苯胺(3，3，5，5，．tetramethylbenzne，TMB)、二环己基碳二亚胺(／、r，N—dicyclohexylcarbodiimide，DCC)、N一羟基琥珀酰亚胺(N—hydroxysucci—nimide，NHS)和二甲基甲酰胺(Dimethylf0rmamide，DMF)均购自美国Sigma公司；羊抗鼠IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司)；2一氯4，6一二氨基一1，3，5．三嗪(2一Chloro-4，6-diamino．1，3，5-triazine，CAAT，比利时AcrosOrganics公司)；三聚氰酸、三聚氰

8、氯(上海国药有限公司)；环丙氨嗪(浙江国邦医药有限公司)；阿特拉津(浙江中山化工有限公司)。其