免疫质谱法检测肝癌血清多肽标志物.pdf

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1、第4O卷分析化学(FENXIHuA)(uE)特约来稿第12期2012年12月ChineseJournalofAnalyticalChemistry1803～1806免疫质谱法检测肝癌血清多肽标志物傅海媛h原剑2,3周晓明孙云波黄亚娟’3侯利平宋纯艳杨保安甄蓓高蓉貌盼勇林利忠徐淑芳肖汉族魏开华(解放军301医院，北京100853)(军事医学科学院放射与辐射医学研究所，北京100850)(北京蛋白质组研究中心，蛋白质组学国家重点实验室，北京102206)(北京正旦国际科技有限责任公司，北京102206)(解放军302医院，北京100039)(湖南金健药、l有限责任公司，常德4

2、15001)摘要建立免疫亲和富集分离与质谱分析相结合的免疫质谱法用于血清多肽标志物pep5的检测。多克隆抗体与蛋白A琼脂糖颗粒偶联用于捕获pep5，基质辅助激光解析电离飞行时间质谱检测标志物。本方法的线性范围为1～48nmol／L，检出限O．2nmol／L；回收率为93．O％～103．1％，相对标准偏差(RSD)为6．4％～11．8％；反复冻融3次pep5，检测结果稳定；检测临床肝癌／JE常血清样本灵敏度为78．0％、特异度为90％。该方法方便、快速、准确，适用于临床样本中低浓度标志物的检测研究，对于癌症的早期诊断具有重要意义。关键词多肽抗体；免疫亲和富集；质谱引言基质辅

3、助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术是一种快速、有效、微量、稳定性好的筛选疾病分子标记方法，可以分析低分子量(~25000D)、低浓度fmol级蛋白质和多肽，已成功应用于乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌等多肽标志物的研究。新兴的免疫质谱技术(Immunomassspectrometry,Immuno—MS)将抗原抗体免疫技术与生物质谱技术联合，除了具有传统免疫放射技术、酶免疫技术和荧光免疫技术的高特异度和灵敏度外，还具有更高的准确性优势。Sparbier等采用免疫磁珠方法提取血清多肽标志物去丙氨酸纤维A(Des—Ala-FPA)，并结合基质辅助激光解析电离飞

4、行时间质谱对Des—Ala-FPA进行定量分析。本实验室前期建立了基于蛋白G琼脂糖颗粒(ProteinGagarosebeads)结合单克隆抗体免疫富集肝癌血清多肽标志物Peptide5(pep5)，采用MALDI—TOFMS对pep5进行了定量检测口】。由于单抗抗原结合位点单一、免疫反应强度弱导致方法检测灵敏度偏低，本研究尝试建立多抗免疫质谱法。大量临床样本检测表明，本研究建立的方法的灵敏度显著优于单抗免疫质谱法。为早期肿瘤诊断提高患者生存率提供了可参考的标志物及诊断方法。2实验部分2．1仪器、试剂和血清样本MALDITOF／TOF(美国应用生物公司)；Milli—Q纯

5、水系统(美国密理博公司)；蛋白A亲和层析柱(SantaCruzBiotechnology公司)；BioLogicDuoFlow层析仪(南京润亚公司)。a一氰基一4_羟基肉桂酸(Fluka公司)；BrukerProteinstandardII(Bruker公司)；ProteinAAgarose(SantaCruzBiotechnology公司)，其余试剂均为分析纯。5O份肝癌样本，经病理学确诊为原发性肝细胞肝癌，由解放军302医院提供；50份正常血清，由空军总医院提供。2．2多克隆抗体的制备与纯化采用碳二亚胺法(EDC)法制备免疫抗原pep5与牛血清白蛋白(BSA)的偶联物

6、BSA-pep5及包被2012-03—20收稿；2012-07-22接受本文系卫生部传染病重大专项(No．2008ZX10002016)，863项目(No．2012AA020205)资助E—mail：wkh2006@gmail．corn,zp1963@sina．corn分析化学第4O卷抗原pep5与鸡卵白蛋白(Ovalbumin，OVA)偶联物OVA-pep5，结合弗氏完全佐剂与不完全佐剂免疫大耳白兔；加强免疫3～4次后，耳缘静脉采血检测滴度，达到取血标准后颈动脉取血，分离出多抗血清；稀释后的多抗血清经过0．22um微孔滤膜过滤后，通过蛋白A亲和层析柱进行亲和纯化，采用p

7、H2．7洗脱缓冲溶液进行洗脱，收集的洗脱液立即用1．0mol／LTris—HC1缓冲液(pH9．0)调整至pH7．0。2．3多抗免疫质谱方法参照单抗免疫质谱方法进行适当优化。取15纯化后的多抗与30蛋白A琼脂糖(ProteinAagarose)悬浮液混合，4℃旋转孵育过夜。100PBS清洗4次后，与24．5gpep5标准品或50临床血清稀释液4℃旋转孵育过夜。100PBS进行清洗，第4次清洗时将ProteinAagarose悬浮液移至另一干净Ep管中。静置沉淀后移除上清液，加入20洗脱缓冲液(5％乙酸)，吸排洗脱5min。静置