人干扰素α2b与IgG-Fc融合蛋白的毕赤酵母发酵工艺.pdf

《人干扰素α2b与IgG-Fc融合蛋白的毕赤酵母发酵工艺.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、中国科学技术大学硕士学位论人干扰素0【2b与IgG—Fc融合蛋白的毕赤酵母发酵工艺作者姓名：学科专业：导师姓名：完成时间：姜合理3旨口J：￡生物化学与分子生物学肖卫华教授二O一二年九月三十日文UniversityofScienceandTechnologyofChinaAdissertationforMaster’SdegreeThefermentationprocessofHumanIFNc七2bandIgG—FCtUSIonproteInInP．pastorisr●。■●-一-oAuthor'sName：HeliJ

2、iangSpeciality：BiochemistryandMolecularBiologySupervisor：Prof．WeihuaXiaoFinishedtime：Sep30，2012中国科学技术大学学位论文原创性声明本人声明所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行研究工作所取得的成果。除已特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含任何他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了明确的说明。作者签名：汕鞋中国科学技术大学学位论文授权使用声明作为申请学位的条件之一，学位论文著作

3、权拥有者授权中国科学技术大学拥有学位论文的部分使用权，即：学校有权按有关规定向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文编入《中国学位论文全文数据库》等有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。本人提交的电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。保密的学位论文在解密后也遵守此规定。作者签名：口保密(——年)导签字日期：力所2。I1·{乙摘要人干扰素融合蛋白作为长效干扰素的一个成员，在延长干扰素体内的半衰期，达到长效的抗病毒、抗肿瘤、抗增殖方面发挥着重要的

4、作用。干扰素与IgG．Fe片段的融合蛋(IFN0‘2b．F∞已经被证明可延长干扰素在大鼠体内半衰期达至65小时，存留时间120ds时以上，这显示了IFNoc_2b．Fc是延长IFN体内血液半衰期的有效方式。本文主要通过构建高表达球Na2b．Fc的毕赤酵母菌株，优化发酵条件建立大规模生产WNa2b．Fc的发酵工艺。毕赤酵母表达外源蛋白有两个常用的启动子，包括甲醇诱导的AOX启动子和甘油组成性诱导的pGAP启动子。载体pucz9K含有AOx启动子，rDNA-pGAP含有pGAP启动子，二者都含有Zeocin筛选标记基因。I

5、FNcc2b．Fc融合基因克隆进pucz9K和rDNA-pGAP质粒中，转入毕赤酵母X-33菌株，通过YPD+Z培养板筛选阳性克隆，进一步通过Westernblot和ELISA方法筛选出高表达克隆。我们对甲醇诱导的毕赤酵母的发酵进行摇瓶水平的发酵的优化，我们从中优化出甲醇诱导阶段的发酵条件，即在温度25℃，pH5左右，甲醇浓度控制在每24／]s时添加至1％左右时发酵产量最大。然后我们研究7．5升发酵罐放大发酵的培养条件，我们发现在发酵的过程中添加酪蛋白可以抑制礤N仅2b．Fc的降解。我们发现用组成型启动子pGAP生产的

6、IFNcc2b．Fc融合蛋白在色层分离后更加容易除去杂蛋白，蛋白序列分析表明IFNoc

7、2b．Fc融合蛋白在Fc区有一个潜在的可被毕赤酵母进行N．糖基化修饰的位点。关键词。干扰素融合蛋白毕赤酵母甲醇诱导组成型表达摘要ⅡAbstractHumaninterferonfusionproteinasamemberofthelong-actinginterferonswinlextendedhalf-lifeinvivoplaysanimportantroleinanti—viral，anti-tumor,andanti-pr

8、oliferationtherapeutics．OurpreviousstudyhasdemonstratedthatfusingtheIFN仅2bgenewiththehumanIgGFcfragmentcallprolongthehalf-lifetO65hoursandtheresidencetimetOmorethan120hoursinrats，suggestingthatIFNa2b—FcisaneffectivestrategyforextendingthebloodcirculationtimeforI

9、FN．Inthisstudyweattempttoestablishthelarge-scaleproductionprocessoftheFNc【．2b-FcfusionproteinbyconstructingIFNa2b—Fchi．ghexpressionPichiaPastorisstrains，andoptimizing