人干扰素α2b与igg-fc融合蛋白的毕赤酵母发酵工艺

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1、目录目录摘要．．．．．．．．．．．．．．．．⋯．．．．．．．．．．．⋯．．．．．：．．．．．．．．．．．．IAbs仃act．⋯．．．．．．．⋯．．．．．．．．⋯⋯．．．．．．．．⋯．．．．．．⋯．．III目录．⋯．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．⋯．．⋯．．．．⋯．．．⋯．．V第1章绪论．．．．．．．．．．．．．．．⋯．．．．．．．．．⋯．．．．．．．．．⋯．⋯ll，l干扰素⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．11．1．1干扰素的发现及其主要里程碑⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．11．1．2干扰素的表达和分类

2、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯21．1．3人干扰素a2b蛋白的性质和其结构⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯41．1．4干扰素转录调节及其信号转导的分子生物学机制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯51．1．5干扰素的生物学功能⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯71．1．6干扰素的临床应用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．91．1．7长效干扰素⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．121．2重组蛋白表达系统⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．⋯⋯⋯．．⋯⋯⋯⋯．151．2．1不同的蛋白表达系统⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．151．2．2毕赤酵母表达系统⋯⋯⋯⋯⋯

3、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．161．2．3外源基因对毕赤酵母蛋白表达系统的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．2l1．2．4毕赤酵母表达蛋白的条件⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．211．2．5毕赤酵母的发酵⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯221．2．6毕赤酵母发酵的下游处理工程⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯231．3毕赤酵母酵母糖基化改造对生产工艺的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．251．4研究意义、内容和方案⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯261．4．1研究意义⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯261．4．2主要研究内容和方案⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

4、⋯⋯⋯⋯⋯．．26第2章实验材料和实验方法．．．．．．⋯．．．．．．．．．．．⋯．．⋯．．．292．1实验材料⋯⋯⋯．．⋯⋯⋯⋯⋯．．⋯⋯⋯．．⋯⋯⋯．．．．292．1．1菌株与质粒⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．292．1．2主要试剂和来自的公司⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯292．1-3实验仪器⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯292．1．4溶液和培养基的配制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．302．2实验方法⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．⋯⋯⋯⋯．322．2．1引物的设计⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

5、⋯⋯．322．2．2质粒的构建⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．：⋯⋯⋯⋯⋯．．⋯⋯．．332．3构建甲醇诱导和组成型毕赤酵母表达菌株⋯⋯⋯⋯．．⋯⋯⋯．372．3．1中抽质粒的线性化和乙醇沉淀⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯372．3。2外源基因导入毕赤酵母⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯382．4转化菌株的高Zcocin抗性梯度纯化以及高表达菌株的筛选⋯⋯⋯39V目录2．4．1IFNot2b-Fe／pucz9k／X．33菌株高表达克隆的筛选⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯392．4．2IFNct2b-Fe／rDNA-pGAP／X．33菌株高表达克隆的

6、筛选⋯⋯⋯⋯⋯⋯．4l2．5删仅2b—Fc高表达菌株细胞种子库的构建⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯412．6菌株发酵条件的优化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯422．6．1温度的优化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯422．6．2pH值的优化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯422．6．3甲醇浓度的优化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯422．7发酵液IFNct2b．Fc蛋白的分离纯化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．432．8SDS．PAGE及糖苷酶处理IFNcz2b．Fe⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯44第3章实验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯

7、453．1毕赤酵母高表达菌株的筛选⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯453．1．1表达载体的构建⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯453．1．2高表达克隆筛选⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯473．2甲醇诱导表达菌种的扩大化培养获得目的蛋白⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．493．3组成型和诱导型两种方式获得的目的蛋白纯化的比较⋯⋯⋯⋯．．523．4IFNa2b-Fc糖基化分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．53第4章讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯554．1IFNet2b．Fc融合蛋白有效提高了干扰素的半衰期⋯⋯⋯⋯⋯⋯554。2毕赤酵母外源蛋

8、白表达系统仍存在缺陷⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯．564．3本实验取得的成果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．57参考文献．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯．⋯⋯⋯59致谢⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。⋯⋯⋯．65Ⅵ第l章绪论1．1干扰素第1章绪论干扰素(Interferon，IFN)是一类由单核细胞和淋巴细胞产生的重要细胞因子，迄今已发现具有抗病